[发明专利]一种对6个血清型霍乱弧菌的实时荧光PCR检测方法及应用

说明书

本发明涉及对霍乱弧菌O14、O22、O34、O37、O59、O140血清型使用基于MGB探针的实时荧光TaqMan聚合酶链式反应快速检测体系进行分析。本发明以霍乱弧菌O抗原基因簇特异基因为靶基因，设计并筛选了用于霍乱弧菌的O抗原分型的引物及MGB探针，并建立了相应的实时荧光PCR（RT‑PCR）检测方法，为利用分子生物学手段对部分致病型霍乱弧菌的O抗原分型提供一条可信的途径。利用本发明的RT‑PCR检测方法可对粪便、呕吐物、河水、井水、海水、生鲜食品、各种材料用具标本中的6个血清型的霍乱弧菌进行准确检测，具有高灵敏度、高特异性及快速检测等诸多优点。

技术领域

本发明属于细菌检测方法技术领域，涉及用于霍乱弧菌6个O抗原血清型的实时荧光PCR检测方法及应用。

背景技术

霍乱弧菌，革兰氏阴性菌，包括两个生物型:古典生物型(Classical biotype)和埃尔托生物型(EL-Tor bio-type)，菌体弯曲呈弧状或逗点状，菌体一端有单根鞭毛和菌毛，无荚膜与芽胞，在碱性平板上菌落直径为2mm,圆形，光滑，透明。霍乱弧菌能发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、半乳糖等产酸产气，迟缓发酵乳糖；能分解色氨酸产生吲哚，同时能还原硝酸盐为亚硝酸盐。霍乱弧菌通过产生肠毒素引起烈性肠道传染病霍乱，可分离于粪便、呕吐物、河水、井水、海水、生鲜食品、各种材料用具标本中。随着抗生素和免疫抑制剂的广泛应用耐药细菌呈现上升趋势，但是在血清水平上，利用创伤抗血清进行鉴定受到变异、可用性和特异性的限制，所以需要一个更具体可行的分子分型方案。已知细菌表面多糖对不同的血清有特异性，如O抗原或荚膜，而根据O抗原的多样性可以对霍乱弧菌的不同菌株进行分型鉴定。

TaqMan-MGB实时荧光PCR（Real-time fluorescence PCR）技术原理：将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值。

TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，其 5' 末端携带荧光基团，如FAM、TET、VIC、HEX等， 3' 端携带淬灭基团，如TAMRA、BHQ等。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq 酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

TaqMan-MGB 探针是近年来在 TaqMan探针的基础上改进的一种新技术,它在探针3′端增加了MGB分子，这种物质能够提高探针的退火温度( Tm值) ，从而使它能够分辨 1个碱基的差别，完全配对，有荧光信号；只要有一个碱基不匹配,就没有信号。探针的设计首先为15-30 nt长度，Tm为68-70 ℃。在探针的 5' 末端，避免了可能引起荧光猝灭的G的存在。探针由AuGCT Biotechnology Corporation（中国北京）合成，分别在 5' 和 3' 末端具有6-羧基荧光素（FAM）和小沟结合（MGB）部分。引物的长度约为25 nt ，Tm在55-60 ℃之间。产生的PCR产物在50-200 bp之间。引物由Invitrogen（中国上海）合成。如果正向引物的3' 末端距离探针的5' 末端1-20 nt（通常为10 nt或更少），则可能更好。