[发明专利]牛支原体P21蛋白及其应用

说明书

本发明公开了牛支原体Mbov_0461基因及其编码的蛋白，属于动物传染病防治与生物技术领域。申请人以牛支原体(M.bovis)HB0801株为模板，设计引物，克隆和表达了Mbov_0461基因编码的蛋白P21，验证其具有免疫原性和反应原性，此外，该蛋白还可黏附胚胎牛肺上皮细胞(EBL)以及与纤连蛋白(Fn)结合，确定该蛋白是一种黏附蛋白，并且抗重组蛋白P21(rP21)的多克隆抗体能明显抑制M.bovis黏附EBL细胞，黏附功能与细菌毒力相关，因此M.bovis P21蛋白也是一种毒力相关蛋白。鉴于以上特性，P21蛋白有望成为M.bovis疫苗、诊断和治疗制剂研发的重要候选靶标。

技术领域

本发明属于动物传染病防治与生物技术领域，具体涉及一种牛支原体P21蛋白及其在牛支原体疫苗、诊断试剂研发和致病机理研究中的应用。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)无细胞壁，属于柔膜体纲支原体属，是引起牛呼吸道疾病的重要病原之一，并导致多种临床病症，主要包括支气管肺炎、乳腺炎、关节炎、中耳炎、生殖道炎、腱鞘炎、脑膜炎、角结膜炎、流产与不孕等。该病原最早于1961年在美国由牛乳汁中分离得到，我国于2008年首次从患病牛肺脏中分离到M.bovis。目前，该病在世界范围内广泛流行，由于其致病机理仍然不十分清楚，致使本病现在仍无有效的防控手段，给养牛业带来重大经济损失，因此，深入研究M.bovis的致病机理，开发新型疫苗和诊断技术具有重要意义。

病原菌对宿主细胞表面的黏附是定植和随后疾病发展的重要先决条件，支原体缺乏细胞壁，细胞膜成分在组织定植和感染中直接与宿主细胞接触，在黏附中起重要作用。在微生物黏附素与宿主细胞受体之间的相互作用中，大多数致病性生物体会结合各种宿主细胞外基质成分，包括纤连蛋白(Fn)，胶原蛋白，弹性蛋白和层粘连蛋白等。Fn是一种高分子量的多功能糖蛋白，在体液中以可溶性二聚体形式存在，在细胞外基质中以不溶性多聚体形式存在。Fn结合蛋白(FnBPs)通过三明治模型促进细菌感染和入侵，其中Fn充当连接细菌黏附素与宿主细胞表面受体的分子桥。革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中的许多FnBP不仅有助于简单的细胞黏附，而且在细菌的毒性特性中也起着重要作用(Henderson等，2011)。因此，鉴定FnBPs对细菌发病机理研究具有重要意义。

大量研究表明，一些Fn结合蛋白基因的失活能显著降低细菌的黏附。此外，一些菌株中Fn结合蛋白基因失活后，毒力显著降低。黏附于宿主Fn，然后成功定植和侵入宿主靶细胞，也是M.penetrans，M.hyopneumoniae和M.gallisepticum等多种支原体的重要特征，在这些支原体中，黏附素是主要的毒力因子之一，并且黏附缺陷型突变体毒力是致弱的。

因此，M.bovis毒力相关蛋白的发掘有助于从蛋白质水平认识其与机体的相互作用关系，从而深入阐明该病的发病机制；此外，新的毒力相关蛋白有可能成为新型疫苗研发的靶标；同时，具有免疫原性和反应原性的蛋白可能成为该病的新型诊断标识。

发明内容

本发明的目的在于提供一种M.bovis P21蛋白，为研发新型疫苗、诊断和治疗制剂提供潜在的候选靶标。

为了实现本发明的目的，申请人以所在华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原分室分离的M.bovis HB0801株为模板，设计引物，克隆了Mbov_0461基因并表达了其编码的蛋白P21，验证其具有免疫原性和反应原性。此外，该蛋白还可黏附牛肺上皮细胞(EBL)以及与纤连蛋白(Fn)结合，是一种黏附蛋白，并且抗重组蛋白P21(rP21)的多抗能明显抑制M.bovis黏附EBL细胞。黏附功能与细菌毒力密切相关，因此，M.bovis P21蛋白是一种毒力相关蛋白，鉴于此，M.bovis P21蛋白是支原体疫苗、诊断和治疗制剂研发的重要候选靶标。

本发明的技术方案具体如下：