[发明专利]基于CBM与纤维素特异性结合的生物传感元件

说明书

本发明利用CBM对纤维素的特异亲和吸附特性构建融合蛋白，融合蛋白包括葡萄糖氧化酶和CBM，进而以纳米纤维素膜作为融合蛋白的固定化载体，用于制备生物传感元件，所得到的生物传感元件能够表现出良好的催化特性和检测稳定性。

技术领域

本发明涉及氧化还原酶基因与碳水化合物结合模块(CBM)基因通过连接肽(linker)基因连接，构建氧化还原酶-linker-CBM融合酶，并利用融合酶制备纳米纤维素载体膜特异性结合的生物传感元件，属于生物酶基因工程和生物传感技术领域。

背景技术

氧化还原酶是生物传感器中关键的检测敏感元件，其有效固定在载体表面且能持久、高效地保持其活性状态，是生物传感器高稳定性和高灵敏度的重要保证。酶分子元件在电极表面固定化通常是利用物理吸附或共价结合等方式将酶分子随机固定在面积不到一平方厘米的载体膜上。但是，生物活性酶分子具有空间三维结构，结合底物的活性中心具有特定取向，酶分子通过非特异性物理吸附或共价结合与载体相互作用常隐藏掉酶分子活性中心或使其不能正确取向，导致酶活大量损失，生物传感器稳定性较差。

近年来，利用生物亲和吸附进行酶的固定化引起越来越多的关注，其最大优势是酶分子可与载体材料特异性结合、固定化方向可控以及酶分子构象改变最小。碳水化合物结合模块(Carbohydrate-Binding Modules，CBM)是天然碳水化合物活性酶分子中没有催化活性，但能在酶分子识别和定向结合底物中发挥重要作用的功能模块，CBM数量众多，对结晶或非晶纤维素、几丁质、木聚糖等多糖具有结合特异性，目前碳水化合物活性酶数据库(http://www.cazy.org)收录了大约10万条CBM序列，根据氨基酸序列相似度(30％)归入86个家族，92个CBM结构得到解析(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)。在天然酶分子中CBMs可以以单独模块或者位于同一家族或不同家族的串联模块连接到催化模块N端或C端，随着分子生物学、合成生物学、计算机辅助模拟等技术发展，目前研究者基于序列结构等生物大数据的挖掘与分析，结合动力学模拟分析蛋白质整体与局域分子动态学行为，建立CBM与目标酶分子的精准嫁接的杂合体文库，并利用融合DNA技术试图获得多种多样CBM与酶分子融合蛋白，以此提高酶分子与底物亲和力、酶分子稳定性或酶活。利用CBM对纤维素的特异亲和吸附特性构建融合酶，并以纳米纤维素膜作为融合酶分子固定化载体，提高酶电极传感器稳定性的改造策略目前国内外几乎未见报道。

发明内容

本发明提供了一种用于生物传感元件的融合蛋白，所述融合蛋白包括葡萄糖氧化酶和碳水化合物结合模块(CBM)。

在一个实施方式中，所述葡萄糖氧化酶(GOD)和CBM通过连接肽连接。

在一个实施方式中，所述GOD来源于Aspergillus niger An76，优选的，所述GOD的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码基因序列如SEQ ID No.2所示。

在一个实施方式中，所述CBM选自第2家族CBM，优选的，所述CBM的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，其编码基因序列如SEQ ID No.4所示。

所述连接肽选自(GGGGS)2、(EAAAK)3或选自Thermobifida fusca基因组中内切-β-木聚糖酶(EM_PRO:Z81013.1)中连接催化结构域和CBM2结构域的天然linker序列中的一种或任意几种；优选的，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，其编码基因如SEQID No.6所示。

在优选的实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。

另一方面，本发明还提供了上述融合蛋白的编码基因，所述融合蛋白的编码基因序列如SEQ ID No.8所示。

另一方面，本发明还提供了上述融合蛋白的制备方法，其包括将编码基因转化到毕赤酵母中，然后进行表达纯化的步骤。