[发明专利]一种金针菇菌株及其鉴定和选育方法

权利要求书

1.一种金针菇菌株(Flammulinafiliformis)，其特征在于，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.19644；

所述金针菇菌株的ITS序列包括SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的两种DNA序列。

2.一种权利要求1所述的金针菇菌株的鉴定方法，其特征在于，包括对所述金针菇的亲本菌株及其原生质体单核菌株进行菌丝培养后提取DNA、ITS序列扩增及测序、SNP位点分析、特异性引物设计与筛选、AS-PCR扩增以及电泳检测；

所述特异性引物包括四组引物，分别是P178-G和P178-A，P217-C和P217-T，P482-C和P482-T，P619-C和P619-T，具体核苷酸序列如下：

引物P178-G正向序列为：ATACCCCATTGGAAGGGTTCG，反向序列为：AGGGAAGCACCAACTAAGGC；

引物P178-A正向序列为：ATACCCCATTGGAAGGGTTCA，反向序列为：AGGGAAGCACCAACTAAGGC；

引物P217-C正向序列为：CCTTCCAGGCCTATGTCTGAC，反向序列为：AGATAAGGGTCCAGCAAGCC；

引物P217-T正向序列为：CCTTCCAGGCCTATGTCTGAT，反向序列为：AGATAAGGGTCCAGCAAGCC；

引物P482-C正向序列为：GCTGGCGGATTGTAC，反向序列为：CTCCGCTTATTGATATGCTT；

引物P482-T正向序列为：GCTGGCGGATTGTAT，反向序列为：CTCCGCTTATTGATATGCTT；

引物P619-C正向序列为：CTGGATACCCCATTGGAAGG，反向序列为：GAAACCACTTCAGAGACGCG；

引物P619-T正向序列为：CTGGATACCCCATTGGAAGG，反向序列为：GAAACCACTTCAGAGACGCA。

3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述ITS序列扩增的反应体系包括：3μL含量为100ng的DNA，2.5μL浓度为10μM的引物ITS1，2.5μL浓度为10μM的引物ITS2，25μL 2×Es TaqMasterMIX，17μL ddH₂O；

所述ITS的扩增程序包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃再延伸5min。

4.根据权利要求2或3所述的鉴定方法，其特征在于，所述AS-PCR扩增的反应体系包括：1μL含量为100ng的DNA，1μL浓度为10μM的上游引物，1μL浓度为10μM的下游引物，10μL 2×Es Taq MasterMIX，7μL ddH₂O；

所述AS-PCR的扩增程序包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃再延伸5min。

5.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，所述引物P178-G的退火温度为68.4℃；引物P178-A的退火温度为68℃；引物P217-C的退火温度为68.5℃；引物P217-T的退火温度为66.7℃；引物P482-C的退火温度为63.1℃；引物P482-T的退火温度为62.9℃；引物P619-C的退火温度为67.4℃；引物P619-T的退火温度为66.4℃。