[发明专利]SpRYn-CBE碱基编辑系统在植物基因组碱基替换中的应用

说明书

本发明公开了SpRYn‑CBE碱基编辑系统在植物基因组碱基替换中的应用。本发明的SpRYn‑CBE碱基编辑系统包括SpRYn、PmCDA1、UGI和sgRNA；所述sgRNA靶向靶点序列。通过实验证明：本发明的SpRYn‑CBE碱基编辑系统可对位于植物基因组上的PAM序列为NAN或NCN或NTN的靶点序列中的碱基C进行编辑，实现碱基C到碱基T的替换，大大拓展了可编辑的C的范围。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及SpRYn-CBE碱基编辑系统在植物基因组碱基替换中的应用。

背景技术

CRISPR-Cas9技术已经成为强有力的基因组编辑手段，被广泛应用到很多组织和细胞中。CRISPR/Cas9 protein-RNA复合物通过向导RNA(guide RNA)定位于靶点上，切割产生DNA双链断裂(dsDNA break，DSB)，而后生物体会本能的启动DNA修复机制修复DSB。修复机制一般有两种，一种是非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)，另一种是同源重组(homology-directed repair，HDR)。通常情况下NHEJ占大多数，因此修复产生的随机的indels(insertions or deletions)比精确修复高很多。对于碱基精确替换，因为HDR效率低以及需要DNA模板，所以使用HDR实现碱基精确替换的应用受到很大的限制。

2016年，David Liu和Akihiko Kondo两个实验室分别独立报道了两种不同类型的胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor，CBE)，分别使用了两种不同的胞苷脱氨酶rAPOBEC1(rat APOBEC1)和PmCDA1(activation-induced cytidine deaminase(AID)ortholog from sea lamprey)，原理都是通过使用胞苷脱氨酶直接实现对单个胞嘧啶(Cytosine，C)碱基进行编辑，而不再通过产生DSB和启动HDR修复，大大提高了C替换为胸腺嘧啶(Thymine，T)的碱基编辑效率。具体为dead Cas9(dCas9)或the Cas9 nickase(Cas9n)连带着rAPOBEC1或PmCDA1通过向导RNA定位到靶点，rAPOBEC1或PmCDA1催化非配对的单链DNA上的C发生胞嘧啶脱氨反应变成尿嘧啶(Uracil，U)，通过DNA的修复使得U与腺嘌呤(Adenine，A)配对，又通过DNA复制，最终使得T与A配对，从而实现了C到T的转换。在所测试的编辑器中，SpCas9n(D10A)rAPOBEC1/PmCDA1UGI碱基编辑系统(其含有尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂(uracil DNA glycosylase inhibitor，UGI)的平均突变率较高，原因有二：一是UGI可以抑制尿嘧啶DNA糖化酶(uracil DNA glycosylase，UDG)催化清除DNA中U，二是SpCas9n(D10A)在非编辑链上产生切口，诱导真核错配修复机制或long-patch BER(base-excision repair)修复机制，促使U:G错配更多的偏好性修复成U:A。

目前，SpCas9n(D10A)rAPOBEC1/PmCDA1UGI碱基编辑系统已被广泛应用到水稻中，实现C到T的转换，但编辑的靶点主要局限在PAM(Protospacer Adjacent Motif)为NGG的序列，大大限制了可编辑的C的范围。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种将植物基因组靶点序列中的C突变为T的方法。

本发明提供的将植物基因组靶点序列中的C突变为T的方法为如下1)或2)或3)或4)：

所述1)包括如下步骤：将SpRYn、胞嘧啶脱氨酶、sgRNA和UGI导入植物体内，实现将植物基因组靶点序列中的C突变为T；

所述2)包括如下步骤：将SpRYn、胞嘧啶脱氨酶和sgRNA导入植物体内，实现将植物基因组靶点序列中的C突变为T；