[发明专利]一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种联产3‑羟基丙酸和1,3‑丙二醇的基因工程菌及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域；本发明中，利用基因工程手段，在E.coli BL21的基础上构建了联合表达琥珀酸半醛脱氢酶（GabD4）和1,3‑丙二醇氧化还原酶（PduQ）的基因工程菌，并通过UTR工程技术提升平衡双酶表达量；并且，本发明中还将构建的基因工程菌与罗伊氏乳杆菌进行多菌混合转化甘油，实现了3‑羟基丙酸和1,3‑丙二醇的高效联产。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

3-羟基丙酸和1,3-丙二醇是工业上两种重要的平台化合物，作为生物可降解性聚合物的前体物质和食品添加剂广泛使用。3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的生产有化学合成法和生物法两种。化学法多以不可再生资源作为原料，其生产过程能耗大，产物副产物多难以分离纯化，生产过程产生不可估量的环境污染。生物法合成3-羟基丙酸和/或1,3-丙二醇多以葡萄糖和甘油作为底物，其中以甘油作为底物生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇步骤简单，研究充分，原料廉价，且能解决甘油过剩的问题。

目前，由于生物合成3-羟基丙酸的过程需要消耗辅酶NAD⁺产生NADH，1,3-丙二醇的生产恰恰相反，将NADH转变为NAD⁺，只能将3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的生产分开进行，否则会造成微生物体内辅酶的不平衡，影响反应持续进行，导致最终产量低。

罗伊氏乳杆菌具有强大的甘油代谢潜力，但其代谢甘油生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的过程中会产生具有细胞和酶毒性的3-羟基丙醛，且3-羟基丙醛的产生速率远大于1,3-丙二醇。3-羟基丙醛的快速积累对细胞和酶系造成毒害，反应也随之停止。因此，解除罗伊氏乳杆菌转化甘油过程中间代谢物3-羟基丙醛抑制问题，才能提升3-羟基丙酸和1,3-丙二醇最终产量。

发明内容

针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌及其构建方法和应用。本发明中，利用基因工程手段，在E. coli BL21的基础上构建了联合表达琥珀酸半醛脱氢酶（GabD4）和1,3-丙二醇氧化还原酶（PduQ）的基因工程菌，并通过UTR工程技术提升平衡双酶表达量。本发明中还将构建的基因工程菌与罗伊氏乳杆菌进行多菌混合转化甘油，实现了3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的高效联产。

本发明首先提供了一种用于高效联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的基因工程菌，所述工程菌命名为E. coli BL21/ pANY-GabD4-PduQ，其通过在E. coli BL21（购自武汉淼灵生物科技有限公司）上构建表达琥珀酸半醛脱氢酶（GabD4）和1,3-丙二醇氧化还原酶（PduQ）而得到。

其中，所述GabD4的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。

所述PduQ的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。

本发明还提供了上述基因工程菌的构建方法，具体包括如下步骤：

（1）琥珀酸半醛脱氢酶（GabD4）工程菌的构建：

PCR扩增来源于钩虫贪铜菌（Cupriavidus necator）的琥珀酸半醛脱氢酶基因（GabD4），使用无缝克隆技术克隆至表达载体pANY1中，经过转化E. coli BL21、筛选阳性克隆以及测序成功获得琥珀酸半醛脱氢酶（GabD4）工程菌E. coli BL21/ pANY-GabD4。

（2）1,3-丙二醇氧化还原酶（PduQ）工程菌的构建：