[发明专利]一种用于检测多粘菌素耐药基因mcr-5的引物、探针及应用

说明书

本申请公开了一种检测多粘菌素耐药基因mcr‑5的引物及探针，并将其制备成试剂盒。涉及分子生物学技术领域，包括1对引物和1个探针，并提供了检测试剂盒和非诊断治疗的检测方法和引物组的应用。本发明仅需具备温控功能的荧光检测仪器，39℃条件下对mcr‑5进行快速、准确、便捷的检测，20min即可得检测结果，灵敏度可达1copies/μL。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于检测多粘菌素耐药基因mcr-5的引物、探针及应用。

背景技术

多粘菌素是聚阳离子多肽类药物，对革兰氏阴性菌耐药菌引起的感染具有良好的疗效，尤其是在耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(Carbapenem-resistant enterobacteriaceae，CRE)等超级耐药菌的治疗上，常作为最后一道防线类药物。

多粘菌素耐药基因mcr由质粒介导，可在不同菌株间进行水平转移，通过介导磷酸乙醇胺转移作用的酶，来参与多粘菌素的耐药过程，此引起了全世界的广泛关注；多粘菌素在医学临床、畜牧业及农业上使用的逐年增加及不合理用药情况，给公共卫生安全和畜牧业发展构成了严重威胁。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶，这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右；此方法与常规PCR、Sanger测序、荧光定量PCR和LAMP等方法相比，不需要复杂的仪器、耗时短、灵敏度高。

mcr-5属于mcr基因家族，首先在嗜水气单胞菌中被发现，mcr-5与以往所报道的任何一类mcr亚型皆亲缘关系较远，但结构与功能分析显示mcr-5与mcr家族的其他成员一样，具有一系列保守的功能残基，包括5个锌离子结合位点与7个PE底物接纳的氨基酸，同时亦发现mcr-5的表达可缓解细菌体内ROS的产生，并引起了代谢适应性损伤，虽然mcr-5具有不同的进化起源，但其依旧保留了相同的生化机制，具有介导多粘菌素耐药的能力。

目前，国内外应用该技术建立了一些致病微生物的新型检测方法，还没有针对mcr-5的RPA检测方法。因此，如何提供一种针对mcr-5的RPA检测方法是本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明公开了一种用于检测多粘菌素耐药基因mcr-5的引物、探针及应用，在体温条件下，即可对mcr-5进行快速、实时、灵敏、准确、便捷的检测。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测多粘菌素耐药基因mcr-5的引物及探针，引物及探针序列如下：

mcr-5-F3：5’-GTCCGTGCTGCACGTTTTAAACCGTAGTGACGTC-3’，SEQ.ID.NO.1；

mcr-5-R1：5’-AGGCAGCGCTCGCCATGGCACAGTGTGGGATG-3’，SEQ.ID.NO.2；

mcr-5-probe：5’-GCGATAACCAGTCGGGCTGTAAAGGCGTCGTGATGGACTGCCCTT-3’，SEQ.ID.NO.3；

探针距离5’端第28位T为FAM荧光基团标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸，第29位和第30位之间插入四氢呋喃分子，第31位T为荧光淬灭基团BHQ标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸。

一种用于检测多粘菌素耐药基因mcr-5的试剂盒，试剂包括：mcr-5-F3、mcr-5-R1、mcr-5-probe、冻干酶粉、聚乙二醇、醋酸镁溶液和去离子水；

各引物浓度为10μmol/L；

探针浓度为10μmol/L；