[发明专利]聚合酶螺旋反应快速检测KSHV的引物组、试剂盒及方法有效
申请号: | 202011043634.7 | 申请日: | 2020-09-28 |
公开(公告)号: | CN112322782B | 公开(公告)日: | 2022-06-10 |
发明(设计)人: | 周素娟 | 申请(专利权)人: | 复旦大学 |
主分类号: | C12Q1/70 | 分类号: | C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11 |
代理公司: | 上海科盛知识产权代理有限公司 31225 | 代理人: | 褚明伟 |
地址: | 200433 *** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 聚合 螺旋 反应 快速 检测 kshv 引物 试剂盒 方法 | ||
1.一种聚合酶螺旋反应快速检测KSHV的引物组,其特征在于,包括检测引物Ft、检测引物Bt、加速引物IF与加速引物IB,检测引物Ft的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,检测引物Bt的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,加速引物IF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,加速引物IB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;
4条引物能够覆盖5个引物区;检测引物Ft、检测引物Bt能够避开疱疹病毒的相似区,能特异性的识别KSHV各个亚型的毒株;通过扩增后的颜色反应就能判断目的基因的存在与否,从而完成KSHV的定性检测。
2.一种聚合酶螺旋反应快速检测KSHV的试剂盒,其特征在于,包括检测引物Ft、检测引物Bt、加速引物IF与加速引物IB,检测引物Ft的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,检测引物Bt的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,加速引物IF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,加速引物IB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;
4条引物能够覆盖5个引物区;检测引物Ft、检测引物Bt能够避开疱疹病毒的相似区,能特异性的识别KSHV各个亚型的毒株;通过扩增后的颜色反应就能判断目的基因的存在与否,从而完成KSHV的定性检测。
3.根据权利要求2所述聚合酶螺旋反应快速检测KSHV的试剂盒,其特征在于,检测引物Ft与检测引物Bt的浓度均为40μM,加速引物IF与加速引物IB的浓度均为20μM。
4.根据权利要求2或3所述聚合酶螺旋反应快速检测KSHV的试剂盒,其特征在于,还包括如下组分:
A、2×反应缓冲液:40.0mM的Tris-HCl,20.0mM的硫酸铵,20.0mM的氯化钾,16.0mM的硫酸镁,0.2%(v/v)的Tween 20,1.4M的甜菜碱,10.0mM的dNTPs;
B、Bst DNA聚合酶;
C、2000×
5.根据权利要求4所述聚合酶螺旋反应快速检测KSHV的试剂盒,其特征在于,组分B中所述Bst DNA聚合酶为浓度为8U/μL的Bst DNA聚合酶水溶液;
组分C中所述的2000×
6.权利要求1所述聚合酶螺旋反应快速检测KSHV的引物组或权利要求2所述聚合酶螺旋反应快速检测KSHV的试剂盒在非疾病诊断与治疗目的检测离体样品中KSHV上的应用。
7.一种非疾病诊断与治疗目的的聚合酶螺旋反应快速检测KSHV的方法,其特征在于,利用检测引物Ft与检测引物Bt,加入加速引物IF与加速引物IB,进行PSR等温扩增反应,检测待检离体样品中的KSHV;
检测引物Ft的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,检测引物Bt的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示,加速引物IF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,加速引物IB的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
8.根据权利要求7所述非疾病诊断与治疗目的的聚合酶螺旋反应快速检测KSHV的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)使用常规核酸抽提方法提取待检离体样品的KSHV DNA作为模板DNA,并检测总DNA的浓度、纯度和完整性;
(2)于65℃水浴中保温60分钟进行聚合酶螺旋扩增反应;其中,聚合酶螺旋扩增反应体系为25μL反应体系:2×反应缓冲液12.5μL,40μM的检测引物Ft、40μM的检测引物Bt各0.5μL,20μM的加速引物IF、20μM的加速引物IB各0.5μL, 8U/μL的Bst DNA聚合酶1.0μL,DNA模板1.0μL,去离子水补足至25μL;最后在反应盖里侧上加入1ul的2000×
(3)待反应完成后,颠倒混匀盖子上的染料,然后用肉眼观察颜色变化,如颜色为橙黄色,说明待检离体样品中KSHV阴性;如颜色为绿色,说明待检离体样品中KSHV阳性。
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