[发明专利]一种通过气管内途径转染的基因在肺组织中高表达的动物模型的制备方法

说明书

本发明公开了一种通过气管内途径转染的基因在肺组织中高表达的动物模型的制备方法。其包括以下步骤：(1)构建携带血管内皮生长因子A的重组病毒载体，并调整病毒滴度为0.5～2×10¹¹PFU/mL；(2)将动物麻醉后悬挂固定，然后照射其颈部，并打开其口腔然后插入气管导管，再将病毒经气管导管注入至动物肺组织中，然后接入呼吸机直至动物清醒，最后拔除气管导管即可。本申请构建了一种通过气管内途径实现重组腺病毒载体在新生大鼠肺组织内靶向转染的动物模型，经气管内转染腺病毒载体，病毒量合适，肺脏以外其他脏器转染率低下，提高了转染靶向性。

技术领域

本发明属于动物模型制备技术领域，具体涉及一种通过气管内途径转染的基因在肺组织中高表达的动物模型的制备方法。

背景技术

基因干预技术是目前临床疾病基础研究的热门技术，该技术通过基因转染能够达到提高或抑制目的基因在组织或细胞内表达的目的，从而对更深入研究目的基因在相关疾病发病机制中的作用具有重要意义。腺病毒载体是基因干预技术的重要媒介，携带目的基因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒基因组的包装质粒共转染HEK293细胞，通过Cre/loxP重组酶系统的作用产生重组腺病毒，感染分裂期和非分裂期细胞，表达目的基因，而腺病毒基因组不整合到宿主细胞染色体内，不能复制，因而是安全、有效的基因载体。

新生大鼠是新生儿疾病基础研究的重要模型动物。利用新生大鼠建立新生儿呼吸系统疾病的基因干预模型常需要将目的基因或其干扰基因片段整合到新生大鼠肺组织中，携带目的基因的腺病毒载体是目前常用的转染媒介，而如何将腺病毒载体转染至肺脏是其关键技术。经尾静脉途径转染腺病毒能够到达肺脏，使目的基因在肺组织内表达，然而新生大鼠体质量小，尾静脉纤细，穿刺困难，且尾静脉血量极少，回血不明显，需注入少量药物才能判断是否穿刺成功，而一旦穿刺不成功，重复穿刺，反复注射药物，可造成尾部水肿，进一步增加了穿刺难度，降低了穿刺成功率，而且反复穿刺造成药物剂量把控困难以及药物浪费，因此为了提高穿刺成功率，研究人员常需等待新生大鼠达到一定的体质量后才开始实验，限制了实验进程。气管内给药是将药物达到肺脏的另一重要途径，然而通过气管内途径实现重组腺病毒载体在新生大鼠肺组织内靶向转染未见相关报道。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种通过气管内途径转染的基因在肺组织中高表达的动物模型的制备方法，可构建一种通过气管内途径实现重组腺病毒载体在新生大鼠肺组织内靶向转染的动物模型。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种通过气管内途径转染的基因在肺组织中高表达的动物模型的制备方法，包括以下步骤：

(1)构建携带血管内皮生长因子A的重组病毒载体，并调整病毒滴度为0.5～2×10¹¹PFU/mL；

(2)将动物麻醉后悬挂固定，然后照射其颈部，并打开其口腔然后插入气管导管，再将病毒经气管导管注入至动物肺组织中，然后接入呼吸机直至动物清醒，最后拔除气管导管即可。

进一步地，重组病毒载体为重组腺病毒载体，其包括元件顺序为CMV-MCS-3FLAG-SV40-EGFP的载体质粒GV314，以及辅助包装质粒。

进一步地，重组病毒载体的构建过程为：

(1)VEGF-A过表达腺病毒载体构建：载体名称为GV314(元件顺序：CMV-MCS-3FLAG-SV40-EGFP)，BamHI/AgeI酶切将载体线性化，通过PCR法扩增目的基因人源化VEGF-A，扩增引物如下所示；

VEGFA(4907-1)-P1:AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGAACTTTCTGCTGTCTTGG；(SEQ ID NO.1)