[发明专利]检测大肠埃希菌和/或志贺菌的底物组合、检测试剂及检测试剂盒

说明书

本发明涉及生物检测领域，特别涉及检测大肠埃希菌和/或志贺菌的底物组合、检测试剂及检测试剂盒。本发明提供的底物组合基于生化和显色原理的快速区分大肠埃希菌和志贺菌的检测试剂盒及其制备方法。使用本发明所述试剂盒，仅需一步操作，即能在1～2h内快速区分大肠埃希菌和鲍氏志贺菌、宋内志贺菌、福氏志贺菌、痢疾志贺菌。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及检测大肠埃希菌和/或志贺菌的底物组合、检测试剂及检测试剂盒。

背景技术

微生物鉴定是食品、药品、海关及临床检验工作中的重要部分。主要方法包括：

(1)基于生化反应谱的生化鉴定:生化鉴定因涉及较多的生化反应，目前已经发展出生化鉴定系统，基于细菌培养及不同细菌表现不同的生化谱实现种属鉴定，鉴定结果准确，可以精确到种甚至亚种，但鉴定细菌种类及速度不及测序技术及质谱技术。

(2)基于16sRNA测序的测序技术：测序技术是根据细菌的基因16sRNA序列不同实现不同种属的鉴定，因其高通量、准确性高被各检验机构所使用。

(3)基于蛋白质图谱的质谱鉴定等。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MassSpectrometry，MALDI-TOF MS)检测微生物蛋白质特征指纹谱，与数据库中的微生物特征蛋白谱比较，确定微生物的种属。特点是快速，操作简便，准确性高。

但对于后面两种技术，有些细菌无法准确区分，比如大肠埃希菌和志贺菌，因为序列比较相似，蛋白图谱基本一致，16sRNA测序及质谱技术无法进行区分。所以如果想要很准确的区分，需要一些特殊处理或者补充实验。

大肠埃希菌和志贺菌属于近缘微生物，大肠埃希菌多数为正常肠道菌群，而志贺菌为致病菌，临床检验时区分志贺菌和大肠埃希菌意义重大。现有专利《一种基于乳糖差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法》(专利号；CN 110144379 A)描述了针对这一技术缺陷的发明专利，此发明是将生化鉴定原理与MALDI-TOF MS技术相结合，将志贺菌和大肠埃希菌培养于含有乳糖或者不含乳糖的培养条件下，诱导大肠埃希菌在不同生长条件下产生差异蛋白，再通过MALDI-TOF MS技术检测差异蛋白，根据差异蛋白检测结果判断是否为大肠埃希菌或志贺菌，实现近亲缘性志贺菌和大肠埃希菌的快速鉴别。

上述鉴定方法(1)所述生化鉴定，可以准确区分大肠埃希菌和志贺菌，但所需时间较长；

上述鉴定方法(2)和(3)无法准确区分大肠埃希菌和志贺菌。因大肠埃希菌和志贺菌属16sRNA序列比较相似，16S rRNA基因全长仅1-2个碱基的区别，无法用测试技术区分。蛋白图谱基本一致，故无法用质谱法对这两种菌进行准确区分。MALDI-TOF MS或者16SrRNA测序鉴定大肠和志贺菌后需要特殊处理或补充的生化试验进行最终鉴定。

专利CN110144379A采用特殊处理的方法，需要提前将待测样本进行组分差异化培养2h-24h以达到菌株特异性蛋白表达，然后再将差异培养后的菌株进行质谱前处理，上机进行质谱鉴定，整个操作过程涉及再次培养、质谱前处理、质谱二次鉴定，步骤繁琐且耗时长。

专利CN110144379A还有一个严重的不足之处：该技术方案中只能鉴定区分为大肠埃希菌和志贺菌属，如为志贺菌属，只能鉴定到属水平，无法鉴定到到志贺菌属下面的具体种。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了检测大肠埃希菌和/或志贺菌的底物组合、检测试剂及检测试剂盒。该底物组合基于生化和显色原理的快速区分大肠埃希菌和志贺菌的检测试剂盒及其制备方法。使用本发明所述试剂盒，仅需一步操作，即能在1～2h内快速区分大肠埃希菌和鲍氏志贺菌、宋内志贺菌、福氏志贺菌、痢疾志贺菌。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：