[发明专利]一种检测RNA依赖性RNA聚合酶活性的酶偶联法

说明书

本发明提供了一种检测RNA依赖性RNA聚合酶活性的酶偶联法，具体包括以下内容：将有活力的RdRp置于冰上解冻，并使用RNA聚合酶缓冲液配制活性RdRp样品溶液；在透明底部的黑色半区96孔板中，加入底物混合液，RdRp酶溶液和焦磷酸酶溶液；再用平板密封膜封住实验孔，置于37℃孵育60分钟；将孔板平衡到环境温度，移除密封膜；每个实验孔中加入100μlGREEN Reagent，在摇床上混合1分钟，然后至于室温孵育30分钟；在紫外分光光度计上读取微孔板在630nm的吸光值；利用焦磷酸标准曲线，确定焦磷酸的产量并计算酶比活力。本发明显著提高的检测灵敏度，带来的更广的分析窗口。

技术领域

本发明涉及酶活性检测技术领域，具体为一种检测RNA依赖性RNA聚合酶活性的酶偶联法。

背景技术

现已知的检测RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)活性的方法很多是采用检测放射性标记的合成的RNA产物延长链。这些方法大多数通过凝胶电泳直观的显示放射性的RNA链，但也有变更过的亲近闪烁法。在亲近闪烁检测法(SPA)中，生物素标记的引物在退火时与模板RNA结合形成双链，在放射性标记的核苷酸存在下，该双链被聚合酶催化延伸。终止反应后，核酸产物获得生物素以及放射性标记，从而被链霉亲和素磁珠捕获并得到检测。尽管放射性产物易检测和定量，但是这些实验中需要合成有放射性标记的分子，这个过程很慢而且昂贵。不仅如此，放射性材料的使用和处理都可能对人体和环境带来巨大的危害。SPA的方法还需要通过额外步骤去分离原料，会增加很多的工作量，可能在实验中引入各种未知变量。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于提供一种检测RNA依赖性RNA聚合酶活性的酶偶联法，以解决上述背景技术中的存在的问题。

本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：一种检测RNA依赖性RNA聚合酶活性的酶偶联法，具体包括以下内容：

(1)将有活力的RdRp置于冰上解冻，并使用RNA聚合酶缓冲液配制2.5倍终浓度的活性RdRp样品溶液；

(2)使用RNA聚合酶缓冲液配制2.5倍终浓度的底物混合液和5倍终浓度无机焦磷酸酶溶液，所述底物混合液为0.5mMrGTP，20μg/ml聚胞苷酸(poly-rC)以及2μg/ml低聚G₁₂的混合物；

(3)在透明底部的黑色半区96孔板中，加入10μl的2.5倍终浓度的底物混合液，10μl的2.5倍RdRp酶溶液和5μl的5倍焦磷酸酶溶液，使初始反应体积达到25μl；

(4)简单的离心，以确保试剂充分混合并聚集在孔板的底部；再用平板密封膜封住实验孔，置于37℃孵育60分钟；

(5)将孔板平衡到环境温度，移除密封膜；

(6)在每个实验孔中加入100μlGREENReagent，在摇床上混合1分钟，然后至于室温孵育30分钟；

(7)在紫外分光光度计上读取微孔板在630nm的吸光值；

(8)利用焦磷酸(PPi)标准曲线，确定焦磷酸的产量并计算酶比活力。

优选的，所述RNA聚合酶缓冲液为：50mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、PH8.0，2.5mMMgCl2混合液，且在使用前加4mMDTT和0.4unit/μlRNA酶抑制剂。

优选的，所述内容(8)中的酶比活力的计算公式为：酶比活力(SA)(nmol/min/mg)＝PPi的产量(nmol)/(反应时间(min)*酶量(mg))。