[发明专利]一种与非梗阻性无精子症诊断相关的精浆外泌体tsRNA标志物及其应用

说明书

本发明公开了一种与非梗阻性无精子症诊断相关的精浆外泌体tsRNA标志物及其应用。该标志物为tRF‑Pro‑AGG‑003和tRF‑Val‑AAC‑010，tRF‑Pro‑AGG‑003的序列为SEQ ID NO.1，tRF‑Val‑AAC‑010的序列为SEQ ID NO.2。该标志物对非梗阻性无精子症具有特异性和灵敏性，可用于制备非梗阻性无精子症的诊断试剂盒。本发明的两个精浆外泌体标志物tRF‑Pro‑AGG‑003和tRF‑Val‑AAC‑010在非梗阻性无精子症和梗阻性无精子症患者精浆中差异表达，其能够较好地诊断性非梗阻性无精子症，并能够预测无精子症取精结果，其效果优于常用的血浆卵泡刺激素水平及睾丸体积等指标。

技术领域

本发明涉及生物诊断和医药领域，具体涉及一种与非梗阻性无精子症诊断相关的精浆外泌体tsRNA标志物及其应用。

背景技术

无精子症的发生率占男性不育症的10％-20％。根据睾丸中有无精子可分为两类：一类是睾丸具有正常精子发生的阻塞性无精子症(obstructive azoospermia,OA)。另一类是睾丸精子发生障碍的非阻塞性无精子症(non-obstructive azoospermia,NOA)。对非阻塞性无精症的准确诊断可以为临床医生提供有价值的指导。尽管精液中的常规生化标志物，例如柠檬酸，酸性磷酸酶，果糖和α-葡萄糖苷酶等可用于辅助诊断OA患者；睾丸体积，血清卵泡刺激素(FSH)水平等可辅助诊断NOA患者，但是仍有一部分患者无法利用这些指标进行正确的诊断。

睾丸活检的病理诊断是确定睾丸精子发生状态的“金标准”。然而，侵入性手术不仅给患者带来痛苦，而且还可能引起生精管的进行性和不可逆转的破坏。睾丸穿刺取精进行辅助生殖是治疗无精子症患者的重要手段，然而睾丸穿刺取精成功率并不高，通过准确、无创的术前评估对提高睾丸穿刺取精成功率具有重要意义。本专利旨在鉴定可以准确评估睾丸精子提取成功率的生物标志物。外泌体是大多数细胞分泌的细胞外囊泡，直径为30-150nm，具有脂质双层膜结构。非阻塞性无精子症患者睾丸不能产生精子，其组织结构与能够产生精子的阻塞性无精子症患者的睾丸组织显着不同。因此，NOA患者和OA患者产生的精浆中的外泌体也不同。因此，精浆外泌体是区分睾丸病理和生理状况的潜在生物标记物的重要来源。

近年来，人们发现一种新型的调控性小非编码RNA，称为tRNA衍生的小RNA(tRNA-derived small RNA,tsRNA)，在人精液中富集。tsRNA是通过对tRNA及其前体进行精确调控而产生的片段。据报道，tsRNA的组成和数量高度依赖于特定的细胞类型和病理状况，使其成为一类出色的生物标志物。最近的研究发现，tsRNA在睾丸和精子细胞中表达。由于tsRNA在哺乳动物的精子成熟和受精中起着重要作用，并且它们在精浆和外泌体中的富集程度高于miRNA，这表明tsRNA可以用作NOA诊断的有前途的生物标记。

发明内容

本发明的目的之一在于克服已有无创诊断指标不能有效诊断非梗阻性无精子症的不足，提供一种与非梗阻性无精子症诊断相关的精浆外泌体tsRNA标志物。

本发明的目的之二在于提供上述精浆外泌体tsRNA标志物的特异性引物。

本发明的目的之三在于提供一种含有上述精浆外泌体tsRNA标志物的特异性引物的非梗阻性无精子症诊断试剂盒。

为实现上述目的，本发明提供一种与非梗阻性无精子症诊断相关的精浆外泌体tsRNA标志物，该标志物为tRF-Pro-AGG-003和tRF-Val-AAC-010，tRF-Pro-AGG-003的序列为：GGCTCGTTGGTCTAGGGGTATGATTCTCG(SEQ ID NO.1)；tRF-Val-AAC-010的序列为GTTTCCGTAGTGTAGTGGTTAT(SEQ ID NO.2)。

精浆外泌体tsRNA标志物tRF-Pro-AGG-003的特异性引物的序列为：

F：GATCGGCTCGTTGGTCTAGG(SEQ ID NO.3)；