[发明专利]人乳头瘤病毒基因，及载体，菌株，表达方法

说明书

本发明涉及经毕赤酵母表达密码子优化的52，31和45型人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1的基因，含有这些基因的载体、菌株，其制备方法，以及表达方法。

本申请是申请日为2013年9月29日，中国国家申请号为201310454513.5，发明名称为“人乳头瘤病毒基因，及载体，菌株，表达方法”的发明申请的分案申请。

技术领域

本领域涉及分子生物学领域，具体而言，本发明涉及经密码子优化而适于在毕赤酵母中表达的HPV52,HPV31,HPV45型人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1的基因，以及含有该基因的载体、菌株及表达该基因的方法。

背景技术

宫颈癌是仅次于乳腺癌的第二大妇科恶性肿瘤，全球每年有超过50万的妇女被诊断出患有宫颈癌，27万妇女死于此病，年龄标准化感染率达10.5％。早在80年代初，Haraldzur Hausen就发现人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)的感染与宫颈癌发病有关，后续的大量研究也已证明HPV与宫颈癌及其癌前病变有密切联系。到目前为止，已发现了百余种HPV基因型，其中约40种可以感染生殖道粘膜。其中高危型HPV型别为HPV16、18、31、33、45、52和58，90％以上的宫颈癌与它们有关。

根据2010年WHO的报告，HPV52是世界范围内宫颈癌中检测率占第7位的高危型别，主要与亚洲地区的宫颈癌相关，而在宫颈高度病变中检出率排在第3位。与HPV16和HPV18型不同的是HPV52的分布有一定的地理偏向性。亚洲HPV感染型别中，HPV52型检出率较高，我国进行的多项研究表明HPV52型也属比较常见的型别。

根据2010年WHO的报告，HPV31是世界范围内宫颈癌中检测率占第6位的高危型别，而在宫颈高度病变中检出率排在第2位。HPV31被认为是宫颈鳞状细胞癌中最普遍的4种高危型之一，在无症状的病人中广泛存在。具体来说HPV31型主要与宫颈上皮内异型增生病变和宫颈癌的形成相关。

HPV45在中国妇女中HPV感染亚型的发生率为2.3％，属于在中国发生率较高的HPV亚型(China Human Papillomavirus and Related Cancers,Fact Sheet 2010,WHO/ICOInformation Centre on HPV and Cervical Cancer,Sep 15,2010)。

HPV是无包膜二十面体对称病毒，其病毒基因组DNA为闭合环状，长度约7200-8000bp，由早期编码区(early region)、晚期编码区(late region)和位于两者之间的长调控区(long control region)组成。其中晚期编码区含两个开放阅读框(ORF)，编码病毒衣壳蛋白L1和L2。L1蛋白分子量约55kDa，为主要衣壳蛋白，以72个五聚体的形式支撑整个病毒衣壳结构，在不同型别中氨基酸序列高度保守，能够刺激机体产生保护性抗体。L2蛋白分子量较小，多位于L1蛋白内部。

昆虫表达系统、酵母表达系统、原核表达系统和哺乳动物细胞等多种表达系统都可以通过单独表达主要衣壳蛋白L1或联合表达L1+L2的方式获得病毒样颗粒(VLP)。L1单独表达得到的VLP与天然病毒衣壳结构类似，可用于诱导与保护免受病毒侵袭有关的高效价病毒中和抗体应答。

因此，鉴于L1蛋白于不同基因型别内部高度保守，并且能够单独表达形成VLP，以L1蛋白作为HPV疫苗研发的目标蛋白具有较高的可行性。不过，以表达重组病毒蛋白得到的VLP作为HPV疫苗的商业化开发与生产需要解决许多技术问题，其中首先需要解决的技术问题就是如何提高重组病毒蛋白的表达水平。而L1蛋白在大肠杆菌、毕赤酵母、杆状病毒等表达系统中，往往受到这些生物体内氨基酸密码子使用频率的限制导致表达水平较低甚至无表达。如Merck公司的美国专利No.7,498,036中记载，野生型VLP蛋白在酿酒酵母中的表达量为35μg/mg(破菌上清液中的VLP/破菌上清液总蛋白)左右。