[发明专利]一种碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体I42A

说明书

本发明公开了一种碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体I42A，属于蛋白质工程技术领域。本发明对从地衣芽孢杆菌基因组中克隆的CcpA基因进行突变，得到的一种碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体I42A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码其的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明构建了包含编码上述CcpA突变体I42A基因的重组表达载体，并将构建的表达载体转化到地衣芽孢杆菌CcpA基因缺陷株中获得重组地衣芽孢杆菌；所获得的重组地衣芽孢杆菌能够明显改变由于葡萄糖存在而产生的碳分解代谢阻遏现象，能够降低地衣芽孢杆菌对木糖的偏好性。

技术领域

本发明属于蛋白质工程领域，涉及一种碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体I42A，还涉及表达该突变体的重组表达载体及重组微生物细胞，进一步涉及该突变体在地衣芽孢杆菌发酵过程中对当木糖与葡萄糖共存时对木糖利用的影响。

背景技术

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是一种革兰氏阳性菌，具有耐热、酶系丰富、产酶量高、生长速率适中、蛋白折叠、全基因组信息公开等优点。与大肠杆菌相比，地衣芽孢杆菌具有耐热性高、pH耐受性较低、生物量高等优势，因此，不仅广泛地被用于外源基因的表达宿主，在发酵工业上也具有巨大的潜力。

木糖作为一种优质碳源，可以通过木质纤维素水解而得到，随着目前环境与能源的压力，木质纤维素等可再生的碳越来越受到人们的青睐。地衣芽孢杆菌可以利用木糖，但是其对木糖的利用会受到葡萄糖的抑制。而木质纤维素在水解过程中产生大量木糖的同时，也会产生大量的葡萄糖。由于碳分解代谢阻遏效应，葡萄糖的存在会抑制地衣芽孢杆菌对木糖的利用，为了消除葡萄糖存在而产生的碳分解代谢阻遏效应，许多解除或者降低碳分解代谢阻遏效应的尝试已经在其他的微生物中进行，主要分为两类：一是通过人为构建代谢途径的方式增加木糖的利用；二是通过对细菌本身的代谢途径进行干预，来构建碳分解代谢阻遏降低的工程菌。但是通过敲除碳分解代谢调控蛋白CcpA蛋白的方式来抑制碳分解代谢阻遏，降低葡萄糖对木糖利用的抑制，增加木糖的利用效率，菌体生长会受到明显的抑制作用，其他的代谢途径也受到明显的影响。因此通过基因敲除构建的工程菌未能投入商业化生产。

因而，目前本领域普遍认为单纯敲除碳分解代谢调控蛋白会导致菌体生长受限，破坏菌体的代谢途径，往往得不到人们预期的结果，随着蛋白质工程的进步，对蛋白的理性改造越来越受到人们的青睐。因此通过对碳分解代谢调控蛋白的活性位点的定向改造来降低由于葡萄糖的存在而引起的木糖利用抑制可能是一个有效的手段。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体I42A(Ile42Ala)及其应用。本发明从地衣芽孢杆菌ATCC 9945A基因组中，克隆得到编码碳分解代谢调控蛋白CcpA蛋白的基因序列，将其编码负责DNA结合结构域的氨基酸进行定点突变，并在大肠杆菌中进行异源表达与纯化；体外测定CcpA蛋白与调控位点cre位点的结合能力，初步筛选出与cre位点结合能力有明显差距的CcpA突变体I42A蛋白；将该突变体蛋白在地衣芽孢杆菌CcpA缺陷株中进行表达，验证该突变体在葡萄糖存在下对木糖利用的影响，得到一种可以改善地衣芽孢杆菌对木糖利用偏好性的CcpA突变体I42A。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体I42A，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明还提供了编码上述碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体I42A的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了含上述基因的重组表达载体。

本发明还提供了表达上述碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体I42A的重组微生物细胞。

进一步地，所述重组微生物细胞以地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)为宿主。