[发明专利]一组扩增李斯特氏菌MLST分型溯源的管家基因的引物组及二代测序建库方法和应用

说明书

本发明提供了一组扩增李斯特氏菌MLST分型溯源的管家基因的引物组及二代测序建库方法和应用，涉及二代测序技术领域。本发明将行业标准《SNT 4525.9‑2016出口食品中致病菌的分子分型MLST方法第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌》里规定的7个管家基因同时建立扩增引物组，并基于所述引物组建立基于二代测序的建库方法，同时一次PCR可以实现7个管家基因的扩增，直接用于建库，操作简单。利用上述方法构建得到的测序文库，可直接进行高通量二代测序，李斯特氏菌株，七基因序列均检出，均可匹配到相应的基因编号。

技术领域

本发明属于二代测序技术领域，具体涉及一组扩增李斯特氏菌MLST分型溯源的管家基因的引物组及二代测序建库方法和应用。

背景技术

据统计，每年有6000多万艘(辆/架)交通工具带来的超过数万亿美元的产品物流进入我国，通过国境口岸的出入境人数超过2亿人次。随着交通工具、货物、人员在国际间的流动日益频繁，旅游和贸易打破了疾病爆发流行的生态地域限制，为传染病及其媒介生物的传播，提供了人为的便利，国际贸易已经成为传播传染病及其媒介生物的重要途径。对输入性的病原体进行分型溯源研究成为了传染病学的一个重要方面。

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，简称单增李斯特氏菌) 属于李斯特氏菌属(Listeria)，是一种人畜共患的病原菌，可引起人和动物的胃肠炎、脑膜炎、败血症和流产等，死亡率可达20～30％。近年来随着冷藏和速冻食品消费量迅速增多，食品中单增李斯特氏菌的潜在危险性也越来越大。

单核细胞增生李斯特氏菌的分型方法包括血清学分型和噬菌体分型等传统分型方法，以及PFGE、RFLP、RAPD、ERIC-PCR、Ribotyping、MLVA、 Rep-PCR等基因分型方法，但是各种方法都有一定的局限性。

而近年来使用越来越频繁的多位点测序分型溯源(MLST)技术越来越展现出在分型方面的强大优势。与传统分子生物学分型方法相比，MLST具有更高的分辨力，能将同种细菌分为更多的亚型，并确定不同ST型之间的系统发育关系以及与疾病的联系。MLST分型中多个管家基因的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的实验室间具有良好的可比性。

MLST越来越多的被作为能进行国际间菌株比较的常用工具，建立一种更为准确的分型系统方法。MLST目前已经成为了细菌分子流行病学研究的一种重要方法，可通过数据库与其它国家和地区的研究结果进行比对，从而更加全面的认识本地区细菌流行的特征。

而随着分子生物学的发展，基因测序日新月异，越来越普及到普通的实验室。测序成本的降低和二代测序技术的发展为MLST技术打开了方便之门，一次扩增可以就可以完成多基因测序成为了MLST技术进步的重要基础。

针对单核细胞增生李斯特氏菌的MLST分型技术早有研究，其行业标准更是已经颁布，但是采用的一代测序的方法还有一定的局限性，本发明针对单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株进行分析，在现有的MLST分型标准基础上，建立新的测序建库方法，可以更方便的开展测序工作，加快MLST分型的速度，减少工作量。选取单核细胞增生李斯特氏菌的7个管家基因作为目的基因：abcZ、bglA、dapE、Cat、Dat、1dh和1hkA多重建库。

目前已经颁布的行业标准《SNT 4525.9-2016出口食品中致病菌的分子分型MLST方法第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌》里规定了7个管家基因用于单核细胞增生李斯特氏菌的MLST分型，但是针对这7个基因的扩增采用普通PCR的方法，测序采用一代测序的方法，一代测序需要针对同一个细菌多次扩增，测序需要外送到第三方公司，操作复杂，工作量大。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一组扩增李斯特氏菌MLST分型溯源的管家基因的引物组及二代测序建库方法和应用，同时一次PCR可以实现所有基因的扩增，直接用于建库，操作简单。