[发明专利]抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体ZJU5-01及其应用

说明书

本发明提供抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU5‑01及其应用。抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No.2，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。对该单克隆抗体进行进一步的理化性状分析和鉴定，并建立了以该单克隆抗体为探针通过胶体金免疫层析试纸条和酶联免疫吸附法检测H5亚型禽流感病毒的方法。本发明为临床样本中H5亚型禽流感病毒感染的辅助诊断提供了有效的工具，并可推广应用于多种检测技术以及临床和实验研究。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备及应用，是利用细胞工程、抗体工程技术，获得分泌抗血凝素蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，通过同品系的小鼠诱导腹水，制备抗血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU5-01，鉴定为IgG2a、κ型，再通过亲和纯化、免疫方法等技术实现对该抗体的应用。

背景技术

H5亚型禽流感病毒包含H5N1、H5N2、H5N6、H5N8等亚类。H5亚型禽流感在亚洲和美洲的爆发摧毁了亚洲的活家禽市场，并对各国经济产生了严重的负面影响。2014年12月到2015年6月，美国经历了最严重的高致病性禽流感事件中，有近50万只家禽被宰杀。2014年以后，H5亚型禽流感病毒在韩国、德国、英国、埃及和荷兰也有被发现，这给当地家禽业造成了一定的经济损失。截至2019年9月，世界卫生组织报告了H5N1禽流感病毒感染的861例实验室确诊病例，455人死亡。H5N6禽流感病毒在中国和东南亚造成19人感染，13人死亡。H5亚型禽流感因其高致病潜力在全球引起了极大的关注和重视。目前，H5亚型禽流感至今仍在鸟类中持续传播，对人类健康和禽类养殖业的发展是一个巨大的威胁。

经典的流感病毒的检测方法是是通过病毒分离再通过血清学方法检测血凝素和神经氨酸酶。近年来，分子检测方法得到巨大的发展，实时定量聚合酶链反应已被广泛用于流感病毒感染的实验室诊断。然而，这些方法对技术和实验室要求很高并且耗时。由于单克隆抗体技术的发展，基于单克隆抗体的检测方法也被广泛使用于检测病毒，如抗原捕获酶联免疫吸附试验和胶体金免疫层析试纸条。上述方法具有快速、灵敏、廉价的优势，这能促进更早更广泛的发现H5亚型禽流感病毒，控制疫情扩散。

综上所述，开发H5亚型禽流感病毒单克隆抗体，用于快速灵敏检测方法的建立对于病毒的防控具有重要的意义。基于以上背景，本项目选定H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白为靶抗原，采用融合杂交瘤技术建立稳定分泌抗血凝素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，并大量制备、纯化和鉴定这些单克隆抗体。该单克隆抗体的成功获得，为建立新型的H5亚型禽流感病毒诊断方法——基于免疫学技术的诊断奠定物质基础。同时对疾病发病机理、预后及疗效判定等方面的研究起到重要作用。

本发明用到杂交瘤细胞技术。该技术将免疫小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以建立分泌均质抗体的杂交瘤细胞系，也称为单克隆抗体技术。该技术涉及到动物免疫、细胞培养、细胞融合、细胞克隆培养和免疫测定等一系列方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体，能识别H5亚型禽流感病毒。该单克隆抗体亚型为IgG2a、κ型，命名为ZJU5-01，能特异性识别禽流感病毒。抗体的重链可变区DNA序列如SEQ ID No.1、重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.2；轻链可变区DNA序列如SEQ ID No.3、轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

SEQ ID No.1

Heavy chain:DNA sequence(363bp)

Signal sequence-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4