[发明专利]一种利用外切葡聚糖酶制备淫羊藿次苷Ⅱ的工艺

说明书

本发明公开了一种利用外切葡聚糖酶制备淫羊藿次苷Ⅱ的工艺，属于分子生物学领域，它包括从淫羊藿中提取淫羊藿苷的方法、制备用于淫羊藿次苷Ⅱ酶解反应的外切葡聚糖酶，以及通过酶解制备获得淫羊藿次苷Ⅱ；本发明同时公开了该外切葡聚糖酶的氨基酸序列以及相应的核苷酸序列，本发明还提供了包含所述基因的表达盒、重组质粒和转化子；本发明优化了淫羊藿苷的提取工艺，通过采用乙醇等绿色环保试剂，降低了环境污染，并通过增加重结晶步骤，提高了产物的纯度，通过在毕赤酵母中表达一种具有高催化活性的外切葡聚糖酶，可将反应的转化率达到98％以上，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及外切葡聚糖酶在淫羊藿次苷II制备中的应用。

背景技术

勃起功能障碍(ED)是男性常见疾病，多由心理性或器质性原因引起，严重影响了夫妻身心健康。据世卫组织统计，全球患有ED的男性约占10％，成年男子中ED患者的比例则达到1/4以上。

据统计，全球每年抗ED一线药物全球市场规模超过40亿美元。我国抗ED市场已超过了百亿元规模，在2012-2016这五年间年平均增长率达到了28.80％。目前抗ED药物主要产品包括西地那非、他达那非、伐地那非等，它们都属于5型磷酸二酯酶(PDE5)抑制剂，可提高性刺激下cGMP浓度而增强勃起功能。但是由于这些口服选择性PDE5抑制剂只可一次性强烈松弛海绵体平滑肌而促进阴茎勃起，治标不治本，同时会引起低血压等副作用，特别是对有心血管疾病患者的安全性颇有争议。因此，开发安全、标本兼治的抗ED新药成为一种必然的要求。

淫羊藿为小檗科淫羊藿属草本植物，其作为壮阳药应用至今已有两千多年的历史。淫羊藿的有效成分淫羊藿苷单体具有显著的抗ED效果，同时对血压没有显著影响，动物实验表明其毒性很低。淫羊藿苷在体内的代谢衍生物淫羊藿次苷Ⅱ具有更显著的生物学功能。分子研究表明，淫羊藿次苷Ⅱ单体不仅是PDE5的特异性抑制剂，同时具有西地那非没有的一些生物学效应，如促进阴茎神经的再生，提高阴茎海绵体神经nNOS的表达等。因此，淫羊藿次苷Ⅱ有望成为新药研究制备用于治疗和预防勃起功能障碍的新药物和保健品，市场前景广阔。

目前国内外关于淫羊藿次苷Ⅱ的研究主要集中在药理和功能方面的研究，但关于淫羊藿次苷Ⅱ的生物制备方面研究较少。随着技术的进步，一些真菌以及分泌酶被发现具有糖基水解酶活性，可用于淫羊藿次苷Ⅱ的制备，但仍然存在真菌培养条件复杂、分泌酶产率低且多为混合物、水解效率低等问题，因为真菌遗传背景复杂，通过基因工程技术大幅提高水解酶在真菌中的表达量和活性较为困难。因此，直接寻找高活性的外切葡聚糖酶，并通过基因工程方法大量表达直接用于生物催化反应的外切葡聚糖酶逐渐成为重要的研究领域。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用外切葡聚糖酶制备淫羊藿次苷Ⅱ的工艺，具有反应高效、条件温和、成本低、产物纯度高，适合工业化生产等优点。

为了达成上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种利用外切葡聚糖酶制备淫羊藿次苷Ⅱ的工艺，该制备工艺包括：

从淫羊藿中提取淫羊藿苷的步骤、制备用于淫羊藿次苷Ⅱ酶解反应的外切葡聚糖酶；以及通过酶解制备获得淫羊藿次苷Ⅱ。

作为优选的方案，所述制备工艺具体包括以下步骤：

(1)淫羊藿苷的提取：选取淫羊藿植物并粉碎至40-60目，并将粉碎物加入至浓度为45-85％的乙醇中进行加热回流1-4小时后得到淫羊藿粗浸膏；将淫羊藿粗浸膏加入至水和乙酸乙酯中溶解并等待其分层，将水相用乙酸乙酯萃取3-5次后合并乙酸乙酯相，并用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干，得干燥物；将干燥物加入至混合溶剂中进行加热回流1-4小时，过滤取滤液干燥后即得淫羊藿苷；

本发明改进了淫羊藿苷提取工艺，其优点是：直接采用混合溶剂反复结晶法，混合溶剂为水与甲醇按照1:2-3的体积比的混合物，较之传统的色谱柱或者大孔吸附树脂分离方法成本更低，溶剂用量少、生产周期短、避免价格昂贵的柱料，便于工厂大规模生产。