[发明专利]一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物、试剂盒及其应用，属于微生物检测技术领域。本发明提供的用于检测非洲猪瘟病毒的引物能够特异性扩增非洲猪瘟病毒的K205R基因序列或其部分序列，具有特异性好、灵敏度高的特点，可以应用于普通PCR平台或者ddPCR平台对非洲猪瘟病毒进行（绝对）定量检测。其中，基于染料法ddPCR技术的检测灵敏度明显高于普通PCR和实时荧光定量PCR（10倍），不仅简化了操作步骤，还能在临床上更加快速、准确地检测出ASFV潜伏期感染的个体，同时对ASFV病毒拷贝数进行绝对定量，为进一步合理制定猪场的防控治疗措施提供了保障。

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物、试剂盒及其应用。

背景技术

非洲猪瘟病毒(African Swine fever virus，ASFV)是一种大型、包膜的双链DNA病毒，主要在巨噬细胞的细胞质中复制。ASFV感染可引起非洲猪瘟(African Swine fever，ASF)，表现为急性、严重的出血热，在家猪和野猪中死亡率较高。

ASFV基因组为双链DNA分子，长度为170-193kb。不同的病毒株因基因组可变区长度不同，基因组大小存在差异。目前已知基因组有151-167个开放阅读框，编码170多种蛋白质，成熟的病毒粒子包含54种结构蛋白。

ASFV颗粒具有由几个同心结构域组成的二十面体形态，由中心基因组形成的内核包含核仁，其被称为核壳的厚蛋白质层包覆，然后是围绕内核的内部脂质包膜，最后是衣壳，也是病毒粒子的最外层。根据编码衣壳蛋白p72的B646L基因序列的不同，AFSV至少可分为24个基因型。根据病毒粒子不同的抗原性，ASFV可分为8个血清型。

研究表明，ASFV可通过猪之间直接接触传播，如口鼻、皮肤伤口等。感染猪的血液中含量大量的病毒，病毒同时也存在于排泄物和分泌物中(如尿液、唾液、粪便等)。ASFV可在肉制品中存活数周至数月，饲喂带毒的餐厨剩余物是导致家猪感染ASFV的重要途径。

目前，ASFV的核酸检测方法主要有普通PCR、实时荧光定量PCR(qPCR)、环介导等温扩增(LAMP)等。普通PCR是最常用的实验室检测方法，具有简单快速、对样品纯度要求低等特点，广泛应用于ASFV的现场检测。由于PCR反应完成后，产物需要进行琼脂糖核酸电泳，观察有无特异性条带，此过程需要开盖，容易造成交叉污染，导致假阳性结果的出现。qPCR与传统的定量技术(如半定量PCR、竞争定量PCR)相比具有重复性好、自动化程度高等优点，但是，在检测过程中需要注意规范操作，否则易出现污染，干扰检测结果。LAMP是在恒温条件下完成的核酸扩增方法，不需要特殊的仪器设备，可以在短时间内肉眼判读结果。但是该方法因缺乏热循环过程中的变性、退火等程序，检测结果易出现假阳性。

数字PCR(ddPCR)是一种基于PCR反应的单分子绝对定量技术，可以精确检测目标基因的拷贝数。在ddPCR方法中，PCR体系被分割成上万个均匀的液滴，目标基因在微滴中分别扩增，成为阳性微滴，然后根据泊松分布计算确定目标基因的确切数量。由于可以绝对定量和具有较高的检测灵敏度，ddPCR经常用于各种研究应用，如病原体检测、突变检测、转基因研究等。将ddPCR技术用于ASFV的检测，在临床上可以更加准确地检测出ASFV潜伏期感染的个体，同时还能对ASFV病毒拷贝数进行绝对定量，有利于病毒感染的早期检测，从而为进一步合理制定猪场的防控治疗措施提供保障。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物，该引物能够特异性扩增非洲猪瘟病毒的K205R基因序列或其部分序列。

其次，本发明提供一种包含上述用于检测非洲猪瘟病毒的引物的试剂盒，该试剂盒能够快速、准确地检测非洲猪瘟病毒，具有特异性好、灵敏度高的特点。

再次，本申请提供一种上述引物或试剂盒在检测非洲猪瘟病毒方面的应用。