[发明专利]一种RNA建库的方法

说明书

本发明公开了一种RNA建库的方法及试剂盒，涉及基因测序领域。所述方法，包括以下步骤：1)合成First cDNA，形成DNA/RNA杂交链；2)用固定有Tn5转座酶复合体的链霉亲和素磁珠对First cDNA杂交链打断并连接接头；3)片段化的杂交链缺口补齐及PCR扩增富集完整的文库。本发明提供的方法不仅建库过程操作简单，最快可以实现2小时完成RNA建库过程；而且，起始RNA的投入量比较灵活，打破了传统的一种Tn5转座酶量只针对特定的RNA的投入量进行建库的约束，降低转座酶对模板投入的依赖性，可以根据自己需求投入10ng到1ug不同量的RNA。

技术领域

本发明涉及基因测序技术领域，具体涉及一种RNA建库的方法。

背景技术

高通量测序技术简写为NGS，可以对数百万条DNA分子序列同时测定；其测序流程包括样本的提取，文库构建，测序及结果分析，文库构建包括RNA文库构建和DNA文库构建。传统的RNA文库构建是mRNA富集后通过高温和Mg²⁺作用打断，然后进行first cDNA的合成，second cDNA的合成，纯化，双链cDNA片段末端修复补平，双链cDNA3’端加A，双链cDNA片段添加接头，文库扩增等步骤进行。此种方法建库周期长，步骤复杂，容易出错。

另外，传统的一种Tn5转座酶量只针对特定的RNA的投入量，转座酶对模板投入量的依赖性较强。

文献“RNA sequencing by direct tagmentation of RNA/DNA hybrids”(DiLin,Fu Yusi,Sun Yue,et al.Proc Natl Acad Sci USA.2020,117(6):2886-2893.)公开了一种新的基于Tn5转座酶的转录组测序快速建库方法，与已有的其它方法相比，大大简化了建库的过程；同时对样品的用量还很小(10ng-100pg)，不仅可以用于高质量的单细胞转录组测序，而且对新型冠状病毒(2019-nCoV)等样本的测序质量和速度可能有一定的提升，但是其对样品量范围仍有一定的局限，使用时影响到效率。

因此，有必要研究一种对样品用量范围更广的RNA快速测序建库方法，通过降低转座酶对模板投入的依赖性，克服建库周期长，步骤复杂，容易出错的缺陷，在满足快速灵活建库的同时，扩大样品量的适用范围。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明提供一种RNA建库的方法，具备灵活及快速的特点，适用于更广的样本用量范围。

为了实现上述目的，本发明提出一种RNA建库的方法，包括以下步骤：

1.投入total RNA合成First cDNA，形成杂交链；

2.用固定有Tn5酶的磁珠在对First cDNA杂交链进行片段化；所述磁珠为链霉素亲和素磁珠；

3.将片段化的杂交链缺口补齐，经扩增得到文库。

进一步地，所述total RNA起始投入量为10ng-1ug。

进一步地，所述固定有Tn5酶的磁珠的制备方法如下：先将突变型Tn5转座酶与带有生物素标记的双链接头复合组装，形成转座复合体；然后将转座复合体与链霉亲和素磁珠进行组装，最后形成Tn5转座酶磁珠复合体。

进一步地，所述步骤1为：反应中加入缓冲液5X First Strand Buffer，Betaine，Oligo(dT)₂₃VN，引物Oligo(dT)₂₃VN与mRNA polyA尾巴结合，通过第一链合成酶混合物，进行链的延伸合成RNA/cDNA杂交链；