[发明专利]一种增强Cas9及其衍生蛋白介导的基因操纵系统的方法及应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种增强Cas9及其衍生蛋白介导的基因操纵系统的方法及应用。本发明提供了一种用于增强Cas9衍生的人工转录因子的方法，即将具有二聚化功能的多肽与Cas9或其衍生蛋白融合。根据上述方法，本发明将具有二聚化活性的CC结构域与人工激活子dCas9‑TV融合后获得新型人工激活子dCas9‑CCTV。该dCas9‑CCTV发生了蛋白质的二聚化，同时具有比原始dCas9‑TV更强劲的基因激活能力，并且在转基因植株中有着良好的多基因激活能力，可以应用于增强Cas9及其衍生蛋白介导的基因操纵系统，使该系统在基因激活生物体的产生方面具有更好的应用价值。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及增强Cas9及其衍生蛋白介导的基因编辑或表达调控的方法，具体涉及一种增强Cas9及其衍生蛋白介导的基因操纵系统的方法及应用。

背景技术

近年来，基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑技术因其简捷、高效等特点被广泛应用于生物基因功能研究、人类临床疾病治疗和作物遗传改良等领域。该系统主要由核酸酶Cas9以及向导RNA（sgRNA）组成。在sgRNA的引导下，Cas9结合于靶标基因位点处，行使核酸酶功能，产生DNA双链断裂，然后由细胞内源修复机制带来突变。科研人员发现，当通过D10A或H840A的氨基酸突变使Cas9的核酸酶活性部分或全部丧失时，其仍具有在sgRNA引导下结合靶标基因位点的功能。根据这一特性，科研人员将具有转录激活活性、转录抑制活性、胞嘧啶脱氨活性或腺嘌呤脱氨活性的多肽分别与前述核酸酶活性部分或全部丧失的Cas9蛋白融合，开发了一系列基于CRISPR/Cas9的转录调控工具和单碱基编辑工具[统称“基因操纵（gene manipulation）工具”]。

随着该技术的广泛应用，科研人员发现在细胞、动物，尤其是植物中，现有的基于Cas9及其衍生蛋白的基因操纵工具的效率尚不能完全满足大家的需求。而在众多基因操纵工具中，Cas9及其衍生的人工转录激活子颇具代表性。

常用的第一代dCas9（nuclease-dead Cas9）人工转录激活子dCas9-VP64是将dCas9与来自人类单纯性疱疹病毒的激活结构域VP64融合，已有的证据表明其不管是在植物还是动物细胞中仅能微弱激活靶基因的表达。近年来，新一代dCas9高效人工转录激活子SAM, SunTag, dCas9-VPR等相继开发应用于动植物细胞中，有效提高了其对靶基因的激活效果，推动了相关研究领域的发展。本团队于2017年，经拟南芥原生质体筛选系统，通过对比融合了不同转录激活结构域的dCas9人工激活子，最终获得了一个高效的人工转录激活子dCas9-TV（Li，Z. et al. A potent Cas9-derived gene activator for plant andmammalian cells. Nature plants，3，930–936，2017）。其不仅能促进植物细胞中目的基因的高效表达，同时也能在哺乳动物细胞中有效激活内源基因的表达。但是，在面对本底表达量较高的基因（如拟南芥FLS2基因）时，dCas9-TV人工转录激活子亦仅微弱激活目的基因AtFLS2表达1.6倍。这说明开发激活效果更强的dCas9人工转录激活子对于本领域的发展仍十分必要。

因此，寻找一个通用地，便捷地增强Cas9及其衍生蛋白介导的基因操纵系统的方法变得十分迫切。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种增强Cas9及其衍生蛋白介导的基因操纵系统的方法及应用，将具有二聚化活性的多肽与Cas9或其衍生蛋白融合后获得的新型人工激活子发生了蛋白质的二聚化，其基因激活能力得到了增强，在转基因植株中有着良好的多基因激活能力。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明提供一种用于增强Cas9衍生的人工转录因子的方法，具体为：将具有二聚化功能的多肽与Cas9或其衍生蛋白融合。