[发明专利]一种基于菠菜绿RNA可视化的方法及其应用

说明书

一种基于菠菜绿RNA可视化的方法及其应用，属于生物学技术领域。本发明包括应用：植物tRNA在保护和/或稳定菠菜绿RNA适配体与荧光素分子DFHBI相互作用并实现菠菜绿RNA在植物体内可视化的应用。还包括一种方法：构建赖氨酸转运RNA‑菠菜绿RNA‑赖氨酸转运RNA，亚克隆至pEAQ‑HT载体中，得到pEAQ‑HT/KSK，用基因枪法将pEAQ‑HT/KSK攻击至无叶绿体的洋葱表皮细胞中，将洋葱表皮放置在高渗培养基上，洋葱表皮浸润至DFHBI溶液中，在激光共聚焦显微镜下观察到足够强的绿色荧光。本发明利用分子信号标记、RNA结合标记蛋白及基于RNA适配体等方法，实现了RNA在植物活细胞内可视化。

技术领域

本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种基于菠菜绿RNA可视化的方法及其应用。

背景技术

RNA主要作为信使将遗传信息从DNA传递到蛋白质。然而，RNA具有更加广泛的功能。越来越的证据证实RNA可以在转录、转录后和翻译水平上调节基因表达。植物中细胞mRNA、小干涉RNA（siRNA）、微小RNA以及病原性病毒和类病毒RNA可以通过胞间连丝在细胞之间移动，以及通过韧皮部高速公路扩散到远端组织。其中一些移动的RNA充当细胞内和细胞间以及系统性信号，以控制植物的防御，生长和发育。例如，流动的赤霉素不敏感基因（GAI）mRNA能够调节拟南芥，番茄和南瓜的叶片形态。CmNACP的系统移动会影响南瓜的芽和根尖分生组织的维持。BEL5 mRNA从叶尖移动到茎尖，促进马铃薯中块茎的形成和发育。移动的AtFT和ATCmRNA能够调控拟南芥开花。此外，许多RNA还能在不同植物之间或同种植物不同生态型之间嫁接的接穗间移动；在寄生植物与寄主之间双向移动，甚至在植物与真菌之间移动。因此，这类移动的RNA具有应对生物或非生物胁迫以及植物的生长发育巨大的潜力。这些新兴的RNA生理学前沿科学，需要开发新技术来对植物RNA进行可视化。

RNA可视化可以通过采用分子信号标记（MBs）、RNA结合标记蛋白（RBLPs）以及基于RNA适配体等方法实现。分子信号标记（MBs）涉及一种特异性探针，在均质溶液中可与靶RNA完美互补。RNA结合标记蛋白（RBLPs），比如MS2，PUM-HD，hnRNPA1，λN22，Cas9，Cas13a等，可以与特定RNA序列结合后可用于检测目标RNA。与MB及RBLP方法检测RNA不同，RNA适配体-菠菜绿（Spinach,也叫24-2或者24-2min）以及它的衍生物Spinach2可以将目标RNA模拟成绿色荧光蛋白（GFP）一样对RNA进行可视化。这些RNA适配体结合荧光素分子DFHBI（3,5-二氟-4-羟基亚苄基咪唑啉酮）后会形成分子内G四联体从而发出绿色荧光。这个技术已经成功应用于大肠杆菌，酵母以及人类细胞的RNA直接标记，并且还用于定量细胞内的微小RNA。与菠菜绿Spinach类似的思路，最近，还开发了一种名为Pepper的荧光RNA适配体。Pepper通过与荧光素（（4-（（（2-羟乙基）（甲基）氨基）-亚苄基）-氰基苯基乙腈）结合在哺乳动物细胞中成像RNA。虽然基于菠菜绿RNA适配体荧光技术在植物领域引起了足够的重视，但一直未成功。本研究中，我们通过在洋葱表皮细胞中瞬时转入菠菜绿RNA，实现了在植物中“RNA模仿GFP”，本技术可用于RNA的可视化。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种基于菠菜绿RNA可视化的方法及其应用。本发明利用洋葱表皮细胞无叶绿体的特点，利用基因枪的高压气体，将包裹有pEAQ-HT/KSK质粒大量导入到洋葱表皮细胞中。再通过DFHBI染料浸润染色后，即可在激光共聚焦显微镜中观察到绿色荧光。

为了实现上述目的，采用以下技术方案：

植物tRNA在保护和/或稳定菠菜绿RNA适配体（Spinach, S）与荧光素分子DFHBI相互作用并实现菠菜绿RNA在植物体内可视化的应用。