[发明专利]一种Siamenoside I的生物合成方法

说明书

本发明涉及本发明属于天然产物生物合成和食品化工技术领域，具体为一种Siamenoside I的生物合成方法；本发明涉及Siamenoside I的制备方法，利用糖苷水解酶选择性水解罗汉果苷V制备罗汉果苷IIIE，使用UDP‑葡萄糖依赖糖基转移酶及其突变体定点糖基化修饰罗汉果苷IIIE，合成Siamenoside I。本发明实现了Siamenoside I的绿色生物合成，为其作为甜味剂或矫味剂开发奠定了物质基础。

技术领域

本发明属于天然产物生物合成和食品化工技术领域，具体涉及糖苷水解酶罗汉果苷V制备罗汉果苷IIIE，UDP-葡萄糖依赖糖基转移酶定点葡萄糖基化修饰罗汉果苷IIIE，生物合成天然非营养型甜味化合物Siamenoside I。

背景技术

甜味剂是食品饮料产品中不可或缺的重要材料。近年来，随着人类生活水平的提高，其消耗量呈指数增长。甜味剂按其来源分类，可以分为人工合成甜味剂和天然甜味剂。天然甜味剂是指从天然产物中提取而得来的甜味成分，主要包括葡萄糖、果糖、蔗糖、甜菊苷、甜茶苷、罗汉果苷、甘草甜素等。人工合成的非营养型甜味剂是一类人工合成或半合成的蔗糖替代物，主要包括阿斯巴甜，安赛蜜，甜蜜素，糖精钠，三氯蔗糖等物质(MooradianAD et al.Clinical Nutrition ESPEN,2017,18:1-8)。人工合成甜味剂的成本低廉，低热量，几乎不被代谢，在食品、饮料、药品中广泛应用。但是，人工合成甜味剂的安全性一直是影响其市场接受度的重要原因。因此，开发对人体健康无危害的天然甜味剂受到市场追捧。

罗汉果(Siraitia grosvenorii)是我国特有的葫芦科植物，主要生长在广西、湖南、广东、贵州等热带、亚热带地区，其甘性凉，有润肺，生津的功效(Liu C et al.FutureMed.Chem,2018,10:845-850)。罗汉果成分分析显示，其含有多种维生素、必需氨基酸、黄酮以及许数种三萜糖苷类化合物，其中葫芦烷型四环三萜皂苷(统称为罗汉果苷)是罗汉果的主要甜味来源，甜度极高，混合糖苷的甜度大约是蔗糖的250-300倍且热量基本为零。罗汉果苷(混合物)凭借安全性、甜度高、低热量的特性已经在全球范围内被用作甜味剂和增味剂。我国在1996年已批准罗汉果苷作为食品添加剂使用。此外，现代药理学实验证明，罗汉苷有降血压、降血脂、保肝、抑菌消炎、抗氧化、增强机体免疫力等多种生物活性(Qi XY etal.Nutr.Res.,2008,28:278-284)，因此，罗汉果苷在食品和医药领域均具有巨大的开发前景。

自1983年Takemoto等从罗汉果中分离提取出甜味化合物罗汉果IV、V和VI以来，已经陆续有超过30种同类化合物被分离鉴定出来(Takemoto T et al.Yakugaku Zasshi,1983,103:1167-1173)。罗汉果醇母核的3位、11位和24位连接葡萄糖的数目是决定罗汉果苷甜度和口感的主要因素。目前，在已发现的罗汉果甜苷中，24位连接3个葡萄糖基，3位连接1个葡萄糖基的Siamenoside I甜度最高(5％蔗糖甜度的563倍)，口感最接近蔗糖。但是，Siamenoside I在罗汉果中的含量极低，提取纯化的收率不足0.045％(Matsumoto K etal.Chem.Pharm.Bull.,1990,38:2030-2032)，且罗汉果的生长周期长，可种植范围较少，以至于其至今未能被开发成非营养型甜味剂。

此外，由于结构中存在多个葡萄糖基团，现有的化学方法难以区域选择性和立体选择性地合成Siamenoside I，而以酶为催化剂的生物催化技术在选择性合成方面展现出了难以匹敌的优势。

发明内容

本发明公开了一种Siamenoside I的全新制备方法，即采用糖苷水解酶选择性水解罗汉果苷V制备罗汉果苷IIIE，使用UDP-葡萄糖依赖糖基转移酶及其全新突变体定点糖基化修饰罗汉果苷IIIE，生物合成Siamenoside I。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案具体如下：