[发明专利]一种利用微生物筛选三甲胺裂解酶抑制剂的方法

说明书

本发明涉及微生物，具体涉及一种利用微生物筛选三甲胺裂解酶抑制剂的方法；一种微生物三甲胺裂解酶抑制剂筛选方法，其特征在于包括以下步骤：将指示菌肺炎克雷伯菌ATCC 13883接种于只含胆碱的特定培养基中；将待筛选物质以低于最低抑菌浓度加入到上述培养基中，37℃，厌氧培养12‑48小时；取培养液测定三甲胺的含量，以未加待检物的培养液为对照，三甲胺的含量低于对照组，说明该物质能够抑制微生物转化胆碱生成三甲胺，是一种三甲胺裂解酶抑制物；该方法不仅具有快速简便，容易操作，试剂需要量少，可进行高通量筛选、且结果准确的优点。

技术领域

本发明涉及微生物，具体涉及一种利用微生物筛选三甲胺裂解酶抑制剂的方法。

背景技术

心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是一组影响心脏和血管的疾病，包括冠心病、心绞痛、心肌梗死、先天性心脏病、高血压、脑卒中、心脏瓣膜病、心肌病等动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)诱导的心血管疾病的重要病理因素，特征是在传导性和阻力性动脉中缓慢进展的炎症，在内皮层下有含胆固醇的低密度脂蛋白(LDL)颗粒堆积。寻找有效抑制动脉粥样硬化的策略对于降低心血管疾病的发病率和死亡率具有十分重要的科学意义。

动脉粥样硬化的发生是基于多种因素的共同作用，多项研究表明氧化三甲胺（TMAO）与心血管疾病风险之间的机制关联。肠道微生物群在动脉粥样硬化的的发病过程中起着至关重要的作用，肠道微生物能够将食物中胆碱、肉碱、甜菜碱等代谢为三甲胺（TMA），三甲胺通过血液循环到达肝脏，在肝脏黄素单氧酶（FMOs）作用下氧化为TMAO。通过控制肠道菌群产生三甲胺可以控制动脉在粥样硬化进程，因此筛选微生物三甲胺裂解酶抑制剂对抗动脉粥样硬化药物的开发具有重大意义。

利用人体微生物群中的酶来寻找新的微生物相关药物靶点治疗心血管疾病，寻找阻断TMA/TMAO形成的方法至关重要。目前，对三甲胺裂解酶抑制剂的筛选主要包括体外同位素标记和体内动物模型两种筛选方法。分析配体和受体之间的匹配度，可以利用计算机辅助药物设计（CADD）极大地加速药物筛选，同位素标记法需要有特定的同位素检测仪器；而动物实验需要饲养动物，费时费力。本发明建立了一种以带有胆碱裂解酶基因CutC的肺炎克雷伯氏菌为指示菌，通过检测三甲胺的含量来筛选微生物三甲胺裂解酶抑制剂，与其他方法相比,具有操作更方便,成本更低等优点。

发明内容

针对上述问题，本发明设计并建立以肺炎克雷伯氏菌为指示菌体外筛选微生物三甲胺抑制剂的方法，并用此方法从化合物库或者新合成的化合物中筛选能够抑制三甲胺产生的化合物。此发明在发现预防和治疗心血管疾病药物的基础研究领域具有一定意义。

技术方案

一种微生物三甲胺裂解酶抑制剂筛选方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将指示菌肺炎克雷伯菌ATCC 13883接种于只含胆碱的特定培养基中；

（2）将待筛选物质以低于最低抑菌浓度加入到上述培养基中，37℃，厌氧培养12-48小时；

（3）取培养液测定三甲胺的含量，以未加待检物的培养液为对照，三甲胺的含量低于对照组，说明该物质能够抑制微生物转化胆碱生成三甲胺，是一种三甲胺裂解酶抑制物。

所述的方法，其特点在于所述的特定培养基为每升培养液中含有：KH2PO4 1 g,K2HPO4 2.5 g, (NH4)2SO4 2 g, MgSO40.1 g 以及2.0834g胆碱。

具体而言