[发明专利]一种带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系、构建方法、鉴定方法及应用在审
| 申请号： | 202010982121.6 | 申请日： | 2020-09-17 |
| 公开（公告）号： | CN112322587A | 公开（公告）日： | 2021-02-05 |
| 发明（设计）人： | 王龙;黄进宇;高贝贝;莫绪明;郭晓令;周亮 | 申请（专利权）人： | 杭州市第一人民医院 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N15/85;C12N15/66;C12N15/65;C12N15/55;C12Q1/6881;G01N33/569;G01N33/577;G01N33/573 |
| 代理公司： | 温州名创知识产权代理有限公司 33258 | 代理人： | 陈加利 |
| 地址： | 310000 浙*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 cas9 基因 人源可 诱导 多能 细胞系 构建 方法 鉴定 应用 | ||
1.一种带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系。
2.如权利要求1所述的带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将能靶向人源iPS细胞AAVS1安全位点区的gRNA序列克隆至带有gRNA克隆位点和Cas9酶基因序列的载体上，得到克隆载体；
（2）将步骤（1）得到的克隆载体和带有药物筛选标记和Cas9酶的基因序列的载体共转入人源iPS细胞中；
（3）通过外加药物进行筛选，获取带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞；
步骤（2）中的药物筛选标记与步骤（3）中外加的药物相对应。
3. 根据权利要求2所述的带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系的构建方法，其特征在于：步骤（1）中，能靶向人源iPS细胞AAVS1安全位点区的gRNA序列为: 5'-CACCGGTCCCCTCCACCCCACAGTG-3' 和3'-CCAGGGGAGGTGGGGTGTCACCAAA-5'。
4. 根据权利要求2所述的带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系的构建方法，其特征在于：步骤（1）中，用
5.根据权利要求2所述的带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系的构建方法，其特征在于：步骤（2）中，通过细胞电转仪将步骤（1）得到的克隆载体和带有药物筛选标记和Cas9酶的基因序列的载体共转入人源iPS细胞中。
6.根据权利要求2所述的带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤（2）中的药物筛选标记为嘌呤霉素药物筛选标记，步骤（3）中外加的药物为嘌呤霉素。
7.根据权利要求6所述的带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系的构建方法，其特征在于：步骤（3）中，将步骤（2）得到的iPS细胞用带嘌呤霉素的培养基培养，筛选出将带有嘌呤霉素抗药性的iPS细胞即为带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞。
8.一种鉴定如权利要求1所述的带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系的方法，其特征在于其包括以下步骤中的一步或多步：
（a）对细胞进行Sanger测序，检测其中是否含有Cas9基因；
（b）对细胞进行扩增保种，然后进行mRNA提取、PCR鉴定，鉴定是否能正常表达GADPH和Cas9基因；
（c）对细胞进行扩增保种，然后进行总蛋白提取，然后进行蛋白印迹检测，鉴定是否能正常表达GADPH和Cas9蛋白。
9.如权利要求1所述的带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系用于构建建立疾病细胞模型的应用。
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