[发明专利]间充质干细胞的驯化培养方法

说明书

本发明涉及间充质干细胞的驯化培养方法。具体涉及无血清驯化培养间充质干细胞的方法，包括如下步骤：采集脐带，剥取华通氏胶，加入完全培养基，于培养箱中静置培养，去除组织块并全量更换完全培养基继续进行培养，得到的细胞接下来进行消化；加胰蛋白酶溶液消化，加入完全培养基中和胰蛋白酶以终止消化过程，得到P0代细胞；将P0代细胞沉淀用含小于10%血清的驯化培养基重悬，于培养箱中静置培养，添加胰蛋白酶溶液消化，中和，得到P1代细胞；接着用依次降低胎牛血清浓度至最终为0%的驯化培养基进行处理，得到最终无血清体外驯化培养的间充质干细胞；任选的，继续用无血清驯化培养基进行培养、传代，本发明方法呈现说明书所述优良效果。

技术领域

本发明属于生物技术和生物医药领域，涉及一种人间充质干细胞的培养方法，更具体地涉及一种无血清体外驯化培养人间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)例如人类的间充质干细胞最早是从骨髓中分离出来的，来源于中胚层的一类具有多向分化潜能和自我更新能力的组织干细胞，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力(Caplan AI. Mesenchymal stem cells. JOrthop Res.1991, 9: 641-650. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999;284: 143-147)。最新的研究表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且易于外源基因导入表达。因此间充质干细胞不但是组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治疗中重要的载体细胞，而且由于间充质干细胞促进造血重建和抑制移植物抗宿主反应功能，在造血干细胞移植和器官移植中具有广泛的应用前景。间充质干细胞具有体外贴壁生长的特性，利用这种特性，人们已经成功从肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、软骨、皮肤、外周血等多种组织中分离培养出间充质干细胞。

目前所报道的间充质干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简便，但供者取髓需要经历一个比较痛苦的手术，并在取材过程中及取材后会有很高的感染机会；由于人体骨髓中MSC的含量极其稀少，每10⁵～10⁶个单个核细胞中大约只有1个，而且随着年龄的增加，骨髓中间充质干细胞的数量、增殖和分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到限制。起源于胚胎发育期胚外中胚层的胎盘是由间质、血管及滋养细胞组成，含有大量的间充质成分。最新的研究表明胎盘中含有丰富的干细胞，从胎盘中分离培养出这些多能干细胞将为实验研究和临床应用开辟一个崭新而丰富的来源。

从胎盘中分离干细胞从而建立胎盘干细胞库已有诸多文献报道，例如CN101270349A(中国专利申请号200810061267.6，公开日2008年9月24日)公开的题为“胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养方法”的发明；CN101693884A(中国专利申请号200910117522.9，公开日2010年4月14日)公开的题为“一种从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取干细胞的方法”的发明；CN102146359A(中国专利申请号201110005964.1，公开日2011年8月10日)公开的题为“从胎盘中提取原始间充质干细胞及无血清扩增的方法”的发明。另外，中国专利申请号201210044648X公开了一种从胎盘中分离间充质干细胞的方法。