[发明专利]一种基于G四链体分子信标双酶级联等温扩增的检测目的miRNA的方法

说明书

本发明公开了一种基于G四链体分子信标双酶级联等温扩增的检测目的miRNA的方法。该方法包括如下步骤：取含有miRNA、反应缓冲液、Bsu DNA聚合酶、Lambda核酸外切酶和G4MB的反应体系，孵育；检测荧光强度；根据荧光强度判断miRNA中是否含有目的miRNA或目的miRNA的含量。G4MB从5’末端至3’末端依次包括DNA片段1、DNA片段2和DNA片段3；DNA片段2的核苷酸序列与目的miRNA的核苷酸序列反向互补；G4MB的一端修饰荧光标记和磷酸基团，另一端修饰猝灭基团。实验证明，本发明提供的方法可以同时检测多种目的miRNA，且准确率高、灵敏度高且特异性好。本发明具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种基于G四链体分子信标双酶级联等温扩增的检测目的miRNA的方法。

背景技术

microRNAs(miRNA)是一类短的非编码RNA(约18-23nt)，在肿瘤的诊断、治疗和预后检测中发挥着重要的作用。miRNA是基因表达的转录后调节因子，调控约30％的已知蛋白编码基因的表达，在细胞增殖、迁移和凋亡等许多基本的细胞过程中发挥关键作用。成熟的miRNA存在于血清、粪便等各种体液中。临床证据表明，miRNA表达含量的异常往往与癌症的发病、癌细胞的侵袭、病灶的转移等有关，例如，miR-21(miR-21-5p)、miR-92a(miR-92a-3p)、miR-31(miR-31-5p)等致癌miRNA经常在结直肠癌发病过程中表现为上调，已被初步用于结直肠癌的早期检测。

早期患者血液中的miRNA的浓度极低，同时miRNA具有体积小、家族成员间序列同源性高、总RNA样本丰度低、易降解等特点，因而很难准确地检测miRNA，阻碍其在临床检测中的发展。RT-PCR由于其高敏感性和易于实施，至今仍是最常用的miRNA检测方法。但是，RT-PCR仍然有关键的限制，包括热循环依赖性高、仪器要求高、样品制备复杂，在实际应用中，其选择性和简单性仍不理想。因此，快速、方便、灵敏、特异的miRNA检测方法仍有很大的发展需求。

基于等温放大的新策略(如基于级联酶扩增策略)比传统的基于PCR的检测具有优势。但大多数级联酶扩增策略通常需要几个单独的步骤，以适应多种酶参与复杂的反应环境所需的不同反应条件。此外，单个miRNA通常与多种疾病相关，因此对单个miRNA的检测和分析不能提供可靠的早期癌症诊断和治疗监测所需的明确结果。鉴于检测多个miRNA所需的并行分析方案实施的复杂性，迄今为止开发的扩增方案很少能够在一个体系内同时实现对多个miRNA的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测目的miRNA的方法。

本发明首先保护一种检测目的miRNA的方法，可包括如下步骤：

(1)取含有miRNA、反应缓冲液、DNA聚合酶、核酸外切酶和G4MB的反应体系，孵育；

(2)完成步骤(1)后，检测荧光强度；

根据荧光强度判断miRNA中是否含有目的miRNA或目的miRNA的含量；

G4MB从5’末端至3’末端依次包括DNA片段1、DNA片段2和DNA片段3；

DNA片段1由1个5’端磷酸化并修饰荧光基团的dT和富G序列(如(GGGACGGG))组成；

DNA片段2的核苷酸序列与miRNA的核苷酸序列反向互补；

DNA片段3由1个3’端修饰淬灭基团的dA和富G序列(如GTGGAGGG)组成；

DNA片段1和DNA片段3由于都存在富G序列在分子内形成绑定的G四链体结构；

所述DNA聚合酶作用于与G4MB的3’末端结合的引物，将引物进行延伸，形成双链DNA；