[发明专利]一种重组人源III型胶原蛋白及其生产方法

说明书

本发明提供了一种重组人源III型胶原蛋白，结构为三螺旋，氨基酸序列还原人体III型胶原蛋白alpha‑1链，包括1068个氨基酸。还提供了上述重组人源III型胶原蛋白的生产方法，其中PBCV‑1的脯氨酸羟化酶，包括209个氨基酸，碱基序列根据酿酒酵母密码子进行优化。本发明提供了与现有技术相比，本发明利用脯氨酸羟基酶在体外实现胶原蛋白链形成三螺旋。采用酿酒酵母表达系统，适于大规模放大，且不含有内毒素，不需要后期去除，生产成本低，进一步提高蛋白表达量。生产的重组人源III型胶原蛋白具有良好的稳定性，其氨基酸组成几乎与天然胶原蛋白alpha‑1链完全一致，应用于人体不会产生免疫排斥。且其生物相容性较好，可以广泛应用于外科医疗和医美行业。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种重组III型人源胶原蛋白及其生产方法。

背景技术

胶原蛋白是广泛存在于人体结缔组织一个重要的结构蛋白，约占人体总蛋白的1/3，占皮肤干重的3/4，在细胞质基质中起到支架作用，使皮肤保持弹性。III型胶原蛋白主要存在于血管、皮肤和肠道中，其流失是导致皮肤衰老的主要原因。因此在目前的医美行业中，III型胶原蛋白是主要的研究对象。

传统获得胶原蛋白的方法是从动物体中提取，处理过程涉及到酸碱酶解，容易使胶原蛋白失去其原本的生理活性，无法发挥其正常的生物学功能。且取自于动物体的蛋白，可能存在病毒隐患，也会导致人体的免疫排斥。

随着现代生物技术的发展，通过基因工程手段获得重组胶原蛋白成为一种可行的方法。且生产成本低，易于放大。以人体本身具有的胶原蛋基因为模板，也可有效避免免疫排斥现象。

发明内容

人体天然III型胶原蛋白三螺旋区域的基本氨基酸结构为（-Gly-X-Y-）n，其中X位氨基酸有28%为脯氨酸，Y位氨基酸有42%为脯氨酸。脯氨酸羟基化是III型胶原蛋白单链形成稳定三螺旋的基础，在此基础上胶原蛋白链才会进一步形成纤维，因此我们使用脯氨酸羟化酶基因进行共表达，使生产出的胶原蛋白形成类似于人体本身具有的III型胶原蛋白的三螺旋结构。小球藻草履虫病毒1的脯氨酸羟化酶基因与人源脯氨酸羟化酶α亚基的基因序列相似，该酶易于表达且不限底物来源。我们在选择宿主方面决定用酿酒酵母表达系统，其不含内毒素且生产成本低，而共表达羟化酶刚好弥补其不具有羟化酶的缺陷。

本发明的目的是提供一种重组人源III型胶原蛋白及其生产方法。

本发明的技术方案提供了一种重组人源胶原蛋白的生产方法，重组人源胶原蛋白利用小球藻草履虫病毒1的脯氨酸羟化酶基因共表达，弥补酵母系统缺乏脯氨酸羟化酶，使脯氨酸顺利羟基化，使单氨基酸链成功形成三螺旋结构。本发明提供的重组人源胶原蛋白是一种重组人源III型胶原蛋白。

进一步的上述重组人源胶原蛋白的生产方法所使用了重组人源胶原蛋白DNA序列，以NCBI数据库Collagen III alpha-1链为模板，按酿酒酵母密码子优化，并规避基因工程操作中会涉及到的酶切位点，带基因工程所需酶切位点合成基因。上述的重组人源胶原蛋白DNA的序列如SEQ ID NO.1：