[发明专利]一种对肺炎链球菌19A血清型荚膜多糖抗原分子分型的LAMP检测方法

说明书

本发明涉及一种对肺炎链球菌19A血清型荚膜多糖抗原分型的LAMP检测方法。本发明以肺炎链球菌19A的荚膜多糖基因簇内的特异基因，即wzy为靶基因，建立了对肺炎链球菌19A的荚膜多糖分型的四条引物，为呼吸道及水环境中肺炎链球菌的荚膜多糖分型提供一条可信的途径。利用本发明的LAMP引物检测呼吸道及水环境中的肺炎链球菌，并且对其进行荚膜多糖分型，具有操作简单、快速高效、高灵敏度等诸多优点。

技术领域

本发明涉及对样品中肺炎链球菌19A血清型菌株荚膜多糖分型的LAMP技术及其制备方法。本发明还设计利用所述的LAMP引物进行检测的方法。

背景技术

ireptococcus），为兼性厌氧的革兰氏阳性菌。肺炎链球菌主要分布在人体的呼吸道，是主要的粘膜病原体，一般条件下无症状，当人体的抵抗力下降时可引发如中耳炎、鼻窦炎与肺炎等感染，严重时还会引发系统性疾病如败血症和脑膜炎等，尤其特别容易感染年龄较大的老人、免疫系统低下的婴幼儿以及重病患者。荚膜为其主要的致病物质，根据荚膜多糖抗原可将其分为90余种血清型，其中致病率较高的血清型有1-5、6A/B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F共23种血清型；其中，1、5、6A/B、14、19F和23F血清型这6种血清型为全球最常见的血清型。

环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification）能在等温（60-65℃）条件下，短时间（通常是一小时内）内进行核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。环介导等温扩增法是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。

其技术原理为：60-65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。

扩增分两个阶段：第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的F1c与此单链上的F1为互补结构。自我碱基配对形成环状结构。以此链为模板，下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端的F1区段为起点。以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。

第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板，形成DNA合成延伸及链置换，形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮的扩增，且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成。周而复始，扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物，且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。

发明内容

为实现上述目的，本发明公开了一种对肺炎链球菌19A血清型荚膜多糖抗原分型的LAMP检测方法，其主要特征在于具有从SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4所示的DNA序列中的一种DNA序列；所述的肺炎链球菌荚膜多糖分型指的是：从肺炎链球菌19A的荚膜多糖基因簇特异基因序列。