[发明专利]一种用于细胞膜修复过程动态监测的拉曼成像方法

说明书

本发明设计一种用于细胞膜修复过程动态监测的拉曼成像方法。该方法用成孔蛋白SLO与二苄环辛基‑磺基‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯(DBCO‑sulfo‑NHS ester)的反应产物SLO‑DBCO作为成孔单体，在活细胞膜上聚集成孔，再利用SLO‑DBCO与拉曼信标分子(对巯基苯甲酸)和叠氮‑聚乙二醇(PEG‑N3)共修饰的金纳米星探针之间的点击反应，将表面增强拉曼(SERS)探针聚集到膜孔周围产生SERS信号，实现膜孔的拉曼成像。在细胞膜修复过程中，膜孔逐渐变小，SLO及其偶联的SERS探针不断地从细胞表面脱落，使SERS信号逐渐降低，直至膜孔完全修复，通过SERS信号的变化实现整个修复过程的动态监测。本发明为细胞膜修复过程的动态监测及其修复机制研究提供了一种简单、灵敏的方法，也为膜孔修复相关疾病的治疗提供了新的技术支撑。

一、技术领域

本发明涉及一种用于细胞膜修复过程动态监测的拉曼成像方法。

二、背景技术

生物膜孔广泛存在于细胞表面，与免疫系统、炎症或其它相关疾病中细胞的死亡息息相关。膜孔可由NK细胞或T细胞分泌的内毒素-穿孔素聚集产生，也可由外毒素，如胆固醇依赖的细胞溶素(CDC)家族中的细菌外毒素-链球菌溶血素(SLO)连至细胞膜后聚集形成。膜孔的形成机制已被很好研究，然而由于相关技术的匮乏，难以进行细胞膜上膜孔修复过程的监测以及修复机制的研究。目前，膜孔的可视化主要通过在固定后的死细胞或者人造磷脂双分子层上借助电子显微镜和原子力显微镜实现。此外，一些基于指示流经膜孔的Ca²⁺或者荧光标记穿孔单体来监测膜孔修复的荧光方法，由于荧光信号读出与实际修复过程不能同步，而且灵敏度也不足，不能指示活细胞上膜孔修复的真实过程。因此，在该领域迫切需要发展一种灵敏的测试方法，实现活细胞上膜孔修复过程的动态监测与修复机制研究。

该专利设计了一种成孔蛋白诱导的动态拉曼成像方法，通过修复过程中表面增强拉曼(SERS)信号的降低，实现对活细胞膜修复过程的动态成像。

三、发明内容

本发明的目的是：基于金纳米星(AuNSs)的聚集产生SERS信号，设计了由成孔蛋白-SLO在细胞膜上聚集，诱导SERS探针在膜孔上聚集而产生的SERS信号。通过细胞膜修复过程中，SLO及其偶联的SERS探针不断地从细胞表面脱落，导致细胞膜上拉曼信号的降低，实现细胞膜修复过程的动态监测，并阐明修复机制，为细胞膜修复相关疾病的治疗提供新的技术支撑。

本发明提出的细胞膜修复的动态SERS成像策略如图1所示。首先合成由二苄环辛基-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(DBCO-sulfo-NHS ester)修饰的SLO(SLO-DBCO)，并用SLO-DBCO在细胞膜上聚集形成膜孔。同时，将拉曼信标分子(对巯基苯甲酸)和叠氮-聚乙二醇(PEG-N₃)同时修饰在AuNSs表面获得SERS探针。SERS探针与细胞膜孔上SLO-DBCO的点击化学反应使其在膜孔周围聚集产生SERS信号，实现膜孔的拉曼成像。在细胞膜修复过程中，膜孔逐渐变小，SLO及其偶联的SERS探针不断地从细胞表面脱落，使SERS信号逐渐降低，直至膜孔完全修复，通过SERS信号的变化实现整个修复过程的动态监测。

本发明通过以下技术方案来实现：

1)将成孔蛋白SLO与DBCO-sulfo-NHS ester在室温下反应2小时，形成具有成孔活性的成SLO-DBCO偶联物。

2)将拉曼信标分子(对巯基苯甲酸)和叠氮-聚乙二醇(PEG-N₃)共修饰在AuNSs表面获得SERS探针。

3)活细胞在含SLO-DBCO的培养液中温育，可使SLO-DBCO在细胞膜上聚集形成大的膜孔。

4)如图1所示，上述组成膜孔的SLO-DBCO通过与SERS探针的点击反应，使SERS探针在膜孔上方聚集，从而产生SERS信号。