[发明专利]一种液体葡萄糖氧化酶复合热稳定剂

说明书

本发明提供一种应用于液体葡萄糖氧化酶的复合型热稳定剂，该稳定剂包含甘油、乳糖、山梨酸钾和水。包含该稳定剂的液体葡萄糖氧化酶制备简单、使用方便、添加量低、价格低廉，具有良好的生物相容性，在60℃处理2h仍有98％酶活，在使用过程遇到高温环境依然能保持较高的酶活，常温保存6个月仍有90％以上酶活，对于葡萄糖氧化酶液体制剂的产业化有重要作用。

技术领域

本发明涉及液体酶制剂领域，更具体地，涉及一种应用于液体葡萄糖氧化酶的复合热稳定剂。

背景技术

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)的系统命名为β-D-葡萄糖氧化还原酶(EC1.1.3.4)，能高效地催化葡萄糖与氧气反应，生成葡萄糖酸和过氧化氢.葡萄糖氧化酶的催化特性使其具有去葡萄糖、脱氧、杀菌等功能，且安全无毒副作用，所以在食品的加工保鲜、医学等方面都有广泛的应用。

近年来，葡萄糖氧化酶作为替代抗生素的新型饲料酶制剂，具有保护动物肠道，促进消化吸收，提高动物机体免疫力等多种功能。葡萄糖氧化酶在饲料应用方面，年需可达30万吨，据估计葡萄糖氧化酶的年总产值在100亿元以上，同时其需求量也以每年10％-30％的速度逐年递增。然而，液体葡萄糖氧化酶往往显示出较弱的热稳定性，在储藏与使用过程中容易失活变性，这极大的限制了葡萄糖氧化酶的应用和发展。因此，如果能有效地提高液体葡萄糖氧化酶的热稳定性，就可以较大程度地避免低温冷藏从而减少资源浪费，同时显著的延长葡萄糖氧化酶的作用时间。总而言之，提高液体葡萄糖氧化酶的热稳定性，在应用和研究中均具有重要的前景和意义。

目前，提高酶热稳定性的方法主要有：化学修饰、固定化、蛋白质工程技术、添加稳定剂等。现就具体案例对不同方法提升葡萄糖氧化酶热稳定性的效果进行如下分析比对：

Kim等人利用壳聚糖、乙酸、三聚磷酸钠(TPP)、吐温20、戊二醛(GA)、硫酸铵、磁性纳米粒子等诸多材料对葡萄糖氧化酶进行了固定化，固定化后的葡萄糖氧化酶在室温下的储藏稳定性有了显著提升(储藏16d后，残留活力能保留90％以上)；但另一方面，该方法使用了繁多的化学试剂(包括昂贵的磁性纳米粒子)，制作过程复杂，难以大规模制备，实际应用价值受到极大的限制{Yeon K M,You J,Adhikari M D,et al.Enzyme-ImmobilizedChitosan Nanoparticles as Environmentally Friendly and Highly EffectiveAntimicrobial Agents[J].Biomacromolecules,2019,20(7).}。

钱军民等人利用HEC/SiO2凝胶复合物包埋的方法对葡萄糖氧化酶进行了固定化，固定化葡萄糖氧化酶的最适反应温度较游离酶提高了4℃。但在固定化过程中，葡萄糖氧化酶酶活有近50％的丧失；同时，固定化葡萄糖氧化酶在50℃下恒温1h后，其相对活力仅为原始活力的65％左右，热稳定性依旧较差[钱军民,李旭祥.HEC/SiO2凝胶复合物包埋固定化葡萄糖氧化酶的研究[J].应用化学,2002,19(002):153-157.]。

中国农业科学院饲料研究所的姚斌等人利用蛋白质工程的方法，对Aspergillusniger来源的葡萄糖氧化酶进行了改造。经5轮突变后，突变体葡萄糖氧化酶-M5的活力较母本提升了66％，热稳定性也有所改善；但该突变体在70℃下处理10min后，活力仅为初始值的55％，依旧难以满足实际生产应用的需求{涂涛,蒋肖,黄火清,罗会颖,姚斌.基于体外分子进化技术提高Aspergillus niger来源葡萄糖氧化酶的热稳定性和催化效率研究[C]}。