[发明专利]一种无蛋白细胞冻存液及其应用

说明书

本发明涉及一种一种新型细胞冻存液及其应用，所述的细胞冻存液包含DMEM/F12、苏氨酸、羟乙基淀粉、棉子糖、聚乙烯醇(PVA)、二甲基亚砜(DMSO)和丙二醇。所述的细胞冻存液无蛋白成分，无动物源成分，化学成分明确，普遍适用于多种细胞类型或组织的超低温存储。本发明还提供了一种细胞冻存液的使用方法，即可进行程序化冷冻，也适用于非程序化冷冻方式。本发明所述细胞冻存液，成分明确，稳定，排除了含血清冻存液的不稳定性，解决了传统含血清冻液可能引入病原菌的风险，无蛋白成分，排除了外源蛋白可能引起的机体免疫反应，安全性更高，尤其适用于临床应用领域。用本发明冻存液保存的细胞，短期冻存一个月后复苏细胞，细胞活率可保持95％以上，保存一年以后复苏，细胞活率仍然可达90％以上，且细胞活性和功能不受影响。

技术领域

本发明属于属于细胞培养技术领域，具体为一种细胞冻存液。

背景技术

细胞冻存即将细胞置于低温环境下保存，以使细胞暂时脱离生长状态，并保持细胞特性。通过冷冻方式保存细胞，成本较低，可以在需要时进行复苏及继续培养。同时，低温保存也能够避免，在培养中因细胞污染而导致的细胞品种丢失。

细胞冻存液作为细胞冻存时必须使用的一种保护试剂，其作用是将需要冻存的细胞悬浮，并供给细胞生命代谢所需的营养物质，同时，通过冷冻保护剂在冻存过程对细胞进行保护，防止或减少冷冻过程中冰晶产生对细胞造成的损伤。

传统的细胞冻存液是在基础培养基中添加胎牛血清和渗透性保护剂DMSO配制而成，或使用90％胎牛血清加入10％DMSO配制而成，但是此种冻存液需依赖血清，受血清批次间的成分波动影响。同时动物来源的血清，成分复杂，需进行病原体鉴定排除人畜共患病风险，即使排除病原体风险，血清内蛋白组分在临床实验或应用中仍有可能引起受体免疫反应，带来安全隐患。随着细胞培养技术的不断更新，无血清培养技术已是一种普遍应用但现有无血清冻存液因含外源蛋白可能引起的免疫反应，也被限制应用，因此无血清且无蛋白，化学成分明确的冻存液越来越受研发人员的青睐。DMSO具有细胞毒性，较高浓度的DMSO对于细胞冻存及临床应用构成风险。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种新型无蛋白细胞冻存液，该细胞冻存液具有高效、广谱、安全等优势，无血清无蛋白、成分明确、易于使用，同时能够高效的维持细胞活性及功能等优点，且非程序化冻存同样适用，可广泛用于各种哺乳动物细胞的冷冻保存。本发明的细胞冻存液DMSO含量可使用在2-10％，低DMSO含量有助于降低DMSO对于细胞的毒性作用，对于临床类应用风险更低。

本发明提供一种新型无蛋白细胞冻存液及其应用，旨在解决现有技术的冻存液成分不明确，安全性差，冻存操作繁琐的技术缺陷。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明公开了一种无蛋白细胞冻存液，包括DMEM/F12、苏氨酸、羟乙基淀粉、聚乙烯醇(PVA)、棉子糖、丙二醇和二甲基亚砜(DMSO)。

优选的，所述DMEM/F12在细胞冻存液中体积占比为88-93％；所述苏氨酸在细胞冻存液中的浓度为0.05g/L；所述羟乙基淀粉在细胞冻存液中的浓度为3-10g/L；所述聚乙烯醇(PVA)在细胞冻存液中的浓度为1-10g/L；所述二甲基亚砜(DMSO)在细胞冻存液中占体积比为5-10％；所述棉子糖在细胞冻存液中占比为0.5-5.0g/L；所述丙二醇在细胞冻存液中体积占比为0.1-2％。

优选的，所述DMEM/F12在细胞冻存液中体积占比为93％；所述苏氨酸在细胞冻存液中的浓度为0.05g/L；所述羟乙基淀粉在细胞冻存液中的浓度为3g/L；所述聚乙烯醇(PVA)在细胞冻存液中的浓度为1g/L；所述DMSO在细胞冻存液中体积占比为5％，所述棉子糖在细胞冻存液中占比为1g/L、所述丙二醇在细胞冻存液中体积占比为2％；