[发明专利]制备串联重复DNA的方法及相关生物材料与应用

说明书

本发明提供一种制备串联重复DNA分子的方法及其相关产品与应用。本发明制备串联重复DNA分子的方法包括将含有名称为单拷贝DNA表达盒的双链DNA分子的表达载体导入受体细胞得到重组细胞，提取所述重组细胞的总RNA，将所述总RNA逆转录成cDNA，得到串联重复DNA分子，极大缩减制备长串联重复序列的时间。实验证明仅需4天便可获得重复10次的串联重复MaSp1，大大缩短了传统方法从MaSp1到MaSp8的时间。通过本发明的实施还能快速得到将拷贝数为7的lir串联重复片段，进而降解为lir小肽。本发明的方法具有实验周期短、节省时间和成本、效率高等特点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中一种制备串联重复DNA的方法及相关生物材料与应用。

背景技术

串联重复DNA是将某一段DNA首尾串联成多个拷贝。串联重复DNA可以用于串联重复蛋白的表达。目前串联重复DNA构建采用的方法有非对称粘性末端互补法和同尾酶法2种。采用非对称粘性末端互补法生成的拷贝数较随机，且需要多种酶进行酶切连接。同尾酶法也比较繁琐，需要反复进行酶切连接。蛛丝具有很高的强度和良好的可塑性，广泛应用的多种领域。在工业领域，例如制备降落伞，防护服，飞行器的复合材料。在生物医药领域，包括伤口缝合线，生物药的运输载体，细胞培养和器官移植的支架。然而，蛛丝很难通过饲养蜘蛛大量获取，因其具有强的领域意识和攻击性。因此，很多研究尝试在其他宿主中表达重组蛛丝蛋白。增加重组牵引丝蛋白的长度被猜测是提高蛛丝纺丝机械性能的关键因素之一。自然界中牵引丝蛋白大小为250-320kDa。2002年，有学者利用哺乳动物细胞表达出60kDa的重组蛛丝蛋白，其纺丝强度比自然界蛛丝韧性低4.2倍。而另一位学者在2010年则利用表达大肠杆菌表达出284.9kDa的重组蛛丝蛋白，且纺丝机械性能与天然蛛丝相似。要表达184.9kDa的重组蛛丝蛋白需要先合成一个重复单元MaSp1，再利用同尾酶无缝拼接技术MaSp2串联体，进而重复相同的方法依次合成MaSp4，MaSp8，MaSp16，MaSp32，MaSp48，最终拼成MaSp96。步骤繁琐，费时费力，且如果想要优化蛛丝序列则需要重新合成基因，再花费大量时间重新构建一系列串联体。

在生物医药领域，小肽具有广阔的应用前景。然而，小肽分子量较低，在表达宿主内易被降解为寡肽，失去生物活性。解决这一问题可通过构建小肽的多拷贝基因表达载体实现。利拉鲁肽(liraglutide，简写lir)属于活性小肽的一种，是治疗糖尿病的高效药物，价格昂贵。Lir只有31个氨基酸，是酰胺化长效GLP-1的类似物，由诺和诺德公司研制而成。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何快速制备高强度蛛丝蛋白或利拉鲁肽。

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种制备串联重复DNA分子的方法，包括将含有名称为单拷贝DNA表达盒的双链DNA分子的表达载体导入受体细胞得到重组细胞，提取所述重组细胞的总RNA，将所述总RNA逆转录(反转录)成cDNA，得到串联重复DNA分子；所述单拷贝DNA表达盒含有启动子，与所述启动子相连的名称为3’内含子的内含子，与所述3’内含子相连的名称为单拷贝DNA的目的DNA，与所述单拷贝DNA相连的名称为5’内含子的内含子；所述3’内含子和所述5’内含子满足条件A，所述条件A为在所述重组细胞中所述单拷贝DNA表达盒转录出的前体RNA通过碱基互补配对形成剪接泡，并通过剪接反应产生成熟的环状单链RNA分子，所述单拷贝DNA不含终止子。

上述方法中，所述cDNA为单链的串联重复DNA分子。

上述方法还可包括将所述cDNA进行扩增得到双链的串联重复DNA分子的步骤。

上述方法中，所述串联重复DNA分子可含有2个以上的所述单拷贝DNA，如7个拷贝以上的所述单拷贝DNA，10个拷贝以上的所述单拷贝DNA。

上述方法中，所述单拷贝DNA表达盒由启动子，所述3’内含子、所述单拷贝DNA和所述5’内含子连接而成。