[发明专利]一种单鼠李糖脂生产菌株及其应用

说明书

本发明一种单鼠李糖脂生产菌株及其应用，属于生物技术领域。本发明以铜绿假单胞菌PAO1菌株作为出发菌株，利用同源重组的方法将其自身的rhlC基因替换为rhlAB‑R基因簇，获得了一株能够专一性生产单鼠李糖脂的铜绿假单胞菌菌株；进一步结合随机诱变，筛选出一株单鼠李糖脂生产水平显著提高的突变菌株。该突变菌株利用市售的金龙鱼葵花籽油作为底物，在5L的生物反应器中，于37℃发酵90小时，单鼠李糖脂的浓度达到62.7g/L，纯度达到95.16％，其中Rha‑C₁₀‑C₁₀的比例最大，占比为68.59％。

【技术领域】

本发明属于生物技术领域。

【背景技术】

鼠李糖脂是由铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或者伯克氏菌(Burkholderia)分泌的一类表面活性分子，属于生物表面活性剂。它具备生物 可降解、低毒性、在极端环境下仍有效等的特性。另外，还具备抑制微生物、 皮肤相容性以及螯合重金属离子处理重金属污染、促进微溶性的有机化合物的 溶解和生物降解。鼠李糖脂的这些特性使得它能够广泛应用于生物防治、化妆 品、医药、洗涤剂、环境清洁以及是由开采等领域。

通常表说的“鼠李糖脂”不是一种单一的结构体，而是由很多种同族结构 组成的混合物，在已知的报道中已经发现多达28种不同结构的鼠李糖脂结构。 其具备一般表面活性剂的基本特征，其亲水基团一般由1～2分子的鼠李糖环构 成，疏水基团则由1～2分子具有不同碳链长度的饱和或不饱和脂肪酸构成。铜 绿假单胞菌分泌的鼠李糖脂的脂链一般包括两个链长相同的羟基脂肪酸链，结 构可以表示为Rha-C₁₀-C₁₀和Rha-Rha-C₁₀-C₁₀。而不同结构的鼠李糖脂同系物的 分布成为了限制鼠李糖脂商品化的一个主要问题。这是由于不同结构的鼠李糖 脂具备不同的溶解性以及表面活性，从而会影响鼠李糖脂产品的物理化学性质 以及产品在高端领域的应用。

为了提高鼠李糖脂在高端领域的应用价值，往往需要对发酵液中的鼠李糖 脂产品进行多级的纯化，已有的数据表明，后期纯化鼠李糖脂的成本占到总成 本的75％左右。因此，一般通过化学合成工艺制备纯度较高的同种鼠李糖脂， 例如GlycoSurf公司使用化学方法生产的鼠李糖脂，原料为鼠李糖，他们可以 利用鼠李糖生产多种鼠李糖脂，从而能够更好地满足客户需求，还减少了发酵 和分离过程的成本，得到更高的产量。但化学合成工艺复杂，成本居高不下。

虽然早在1980年，研究人员就从外耳感染病人中分离出了一株铜绿假单胞 菌ATCC 9027(DSM 1128)，可以专一的生产单鼠李糖脂，但在37℃条件下，其 生产的单鼠李糖脂水平远远低于铜绿假单胞菌PAO1菌株(Complete genome sequence of Pseudomonasaeruginosa PAO1,an opportunistic pathogen. Nature 2000,406:959-964.)；尽管在小鼠模型中，研究人员验证了 ATCC9027菌株不存在感染性，但在30℃条件下，ATCC9027菌株生产的绿脓菌 素水平远远高于PAO1菌株，这仍然是一个不容忽视的问题；这些问题都大大限 制ATCC9027菌株的应用(María-Victoria Grosso-Becerra et al., Pseudomonasaeruginosa ATCC 9027is a non-virulent strain suitable for mono-rhamnolipidsproduction)。