[发明专利]一种鲜马乳中乳脂肪球膜的提取及其蛋白质组学分析方法

权利要求书

1.一种鲜马乳中乳脂肪球膜的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，将罗氏蛋白酶抑制剂加入到鲜马乳中，罗氏蛋白酶抑制剂和鲜马乳的比例为42mg：50mL，将得到的混合体系离心后得到乳脂肪层，将乳脂肪层依次用磷酸盐缓冲液和十二烷基硫酸钠溶液清洗后，得到乳脂肪球膜蛋白的十二烷基硫酸钠溶液；

步骤2，按(1-2.4)μmol：(80-90)μL的比例，将二硫苏糖醇加入到乳脂肪球膜蛋白的十二烷基硫酸钠溶液中，得到的混合体系A在46℃-50℃下孵育后冷却至室温后，得到混合体系B；

步骤3，向混合体系B中加入碘乙酰胺至碘乙酰胺的最终浓度为60mM-70mM，之后将得到的混合体系C在室温下避光孵育后，得到混合体系D，再向混合体系D中加入尿酸缓冲液去除二硫苏糖醇和碘乙酰胺，得到混合体系E；

步骤4，向混合体系E中加入碳酸氢铵溶液去除尿素和Tris-HCl，之后向得到的混合体系中加入含有胰蛋白酶的碳酸氢铵溶液，胰蛋白酶与该混合体系中乳脂肪球膜蛋白的质量比为1:(60-80)，得到混合体系F，将混合体系F在35℃-40℃下酶解后得到酶解液；

步骤5，将酶解液进行终止消化，得到含有肽混合物的溶液，将含有肽混合物的溶液进行脱盐后冷冻干燥，得到肽混合物，完成对鲜马乳中乳脂肪球膜的提取。

2.根据权利要求1所述的鲜马乳中乳脂肪球膜的提取方法，其特征在于，步骤1将得到的混合体系在0℃-4℃下于10000r/min-12000r/min离心40min-60min后得到乳脂肪层。

3.根据权利要求1所述的鲜马乳中乳脂肪球膜的提取方法，其特征在于，步骤1先在乳脂肪层中加入pH＝6.8-7.2的磷酸盐缓冲液，乳脂肪层与磷酸盐的比例为1L:(0.21-0.35)mol，之后超声25min-30min，再在0℃-4℃下以10000r/min-12000r/min离心40min-60min，得到第一次清洗的乳脂肪层，之后按照上述清洗过程对第一次清洗的乳脂肪层清洗2-4次，得到初步提纯的乳脂肪层，完成磷酸盐缓冲液对乳脂肪层的清洗。

4.根据权利要求3所述的鲜马乳中乳脂肪球膜的提取方法，其特征在于，步骤1先在初步提纯的乳脂肪层中加入质量分数为0.7％-1.0％的十二烷基硫酸钠溶液，该溶液与初步提纯的乳脂肪层的体积比为1:1，之后超声洗涤10min-15min，最后在10000r/min-12000r/min、0℃-4℃下离心40min-60min，得到乳脂肪球膜蛋白的十二烷基硫酸钠溶液。

5.根据权利要求1所述的鲜马乳中乳脂肪球膜的提取方法，其特征在于，步骤2将混合体系A在所述温度范围下孵育2h-2.5h。

6.根据权利要求1所述的鲜马乳中乳脂肪球膜的提取方法，其特征在于，步骤3将混合体系C在室温下避光孵育40min-60min。

7.根据权利要求1所述的鲜马乳中乳脂肪球膜的提取方法，其特征在于，步骤4将混合体系F在所述温度范围下酶解8h-10h得到酶解液。

8.一种鲜马乳中乳脂肪球膜的蛋白质组学分析方法，其特征在于，基于权利要求1-7中任意一项所述的鲜马乳中乳脂肪球膜的提取方法，包括以下步骤：

步骤1，采用液相色谱-高分辨质谱技术在数据依赖的扫描模式下对权利要求1-7中任意一项所得的肽混合物的甲酸水溶液进行信息采集，获得m/z为300-1700范围内的肽段；

步骤2，先对m/z为300-1700范围内的肽段进行解卷积处理，完成峰提取和峰对齐，之后对得到的蛋白质种类和数量进行定性分析，再对得到的LFQ响应强度进行统计学分析，筛选显著性表达蛋白质，最后通过构建热图分析模型完成显著性表达蛋白质的聚类和差异可视化；

步骤3，对聚类和差异可视化的显著性表达蛋白质进行生物信息学分析，完成鲜马乳中乳脂肪球膜的蛋白质组学分析。