[发明专利]一种大量获得间充质干细胞细胞生长因子的方法

权利要求书

1.一种大量获得间充质干细胞细胞生长因子的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)间充质干细胞的分离：通过组织贴壁或酶消化法提取间充质干细胞，然后对提取的间充质干细胞进行指标检测；

(2)扩增培养：将检测合格的间充质干细胞接种于培养容器中，加入培养基，然后置于低氧环境下进行培养；其中培养基成分：体积浓度为2％的GlutaMAX^TM-I和体积浓度为10-20％的FBS，其余为DMEM；

(3)细胞培养上清液的收集：待细胞融合度达到75％-85％时，将培养容器中的氧浓度调整至0.8-1.8％(v/v)，然后继续培养细胞24小时；

(4)联合超滤浓缩：将步骤(3)中培养好的细胞用0.25％胰酶-EDTA溶液消化4-5min，消化完毕后，将其置于20℃，1000-2000r/min条件下离心2-3min，然后去掉上清液，用0.9％生理盐水清洗沉淀3-4次，然后用0.9％生理盐水调整其细胞浓度为1-10×10⁷个细胞/mL，然后再加入1.5-2.5mg/mL的EDTA和6-9mg/mL的Vc，混匀；将细胞置于20℃4000-10000r/min条件下离心6-8min，然后用0.22μm滤膜过滤，然后通过50KD超滤膜，收集透析液，再将透析液通过1KD滤膜，收集截留液，得到细胞因子浓缩液。

2.根据权利要求1所述的大量获得间充质干细胞细胞生长因子的方法，其特征在于，步骤(1)中间充质干细胞为多能诱导干细胞。

3.根据权利要求1所述的大量获得间充质干细胞细胞生长因子的方法，其特征在于，步骤(1)中指标检测包括无菌检测、支原体检测、流式检测和核型检测。

4.根据权利要求1所述的大量获得间充质干细胞细胞生长因子的方法，其特征在于，步骤(2)中低氧环境条件为37℃、5％CO₂。

5.根据权利要求1所述的大量获得间充质干细胞细胞生长因子的方法，其特征在于，步骤(2)中间充质干细胞的浓度为2×10⁶个细胞/cm²。

6.根据权利要求1所述的大量获得间充质干细胞细胞生长因子的方法，其特征在于，步骤(3)中的氧浓度为1.2％。

7.根据权利要求1所述的大量获得间充质干细胞细胞生长因子的方法，其特征在于，步骤(4)中所添加的EDTA的浓度为2.5mg/mL，Vc的浓度为9mg/mL。