[发明专利]一种维持细胞表型的三维扩增方法

说明书

本发明提供了一种维持细胞表型的三维扩增方法，所述方法包括以接种量1×10⁴个/ml将肝干细胞接种于壳聚糖多孔凝胶中，置于培养基中，使多孔凝胶与培养基的体积比为2:5，在37℃，体积分数5％CO₂的条件下培养，培养3周，每五天分别更换新鲜培养基，本发明提供的方法可以显著提升细胞增值率并且可以保持肝细胞培养过程中的细胞表型，降低培养过程中的肝细胞损伤率。

技术领域

本发明涉及干细胞扩增领域，特别地涉及一种维持细胞表型的三维扩增方法。

背景技术

多年来对干细胞的定义不断进行修正，并从不同的层面上来进行定义。目前大多数生物学家和医学家认为干细胞是来自于胚胎、胎儿或成体内具有在一定条件下无限制自我更新与增殖分化能力的一类细胞，能够产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，也能产生组成机体组织、器官的已特化的细胞，同时还能分化为祖细胞。

干细胞是对疾病进行基因治疗时理想载体。造血干细胞具有自我更新、多向分化重建长期造血、采集和体外处理容易等特点。因此是基因治疗最理想的载体细胞之一，以此为基础的基因治疗，在重症免疫缺陷、遗传性疾病、恶性肿瘤、造血干细胞保护、AIDS等领域具有广阔的应用前景。

骨髓间充质干细胞易于外源基因的导入和表达，这种特点结合骨髓间充质干细胞的多向分化潜能，便使其可能成为一种理想的基因治疗的靶细胞。此外，人胚胎干细胞可以不断自我更新，经过遗传操作后依然能够稳定地在体外增殖，将其作为基因治疗的载体，将有可能解决目前基因治疗中所面临的用作载体的细胞在体外不能被稳定改造和传代的问题。胚胎干细胞的遗传改造将有可能被用于遗传性疾病的治疗领域。

目前人们普遍关注的干细胞分离纯化技术的进步、基因转染效率的提高、基因转移载体(脂质体、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等)的不断改进及转基因细胞的扩增和定向诱导分化、新的目的基因的发现、目的基因转染后的稳定表达和调控等领域的深入研究将使得与干细胞相关的基因治疗更加有效和广泛地应用于临床。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种维持细胞表型的三维扩增方法

本发明是以如下技术方案实现的：

一种维持细胞表型的三维扩增方法，所述方法包括以接种量1×10⁴个/ml将肝干细胞接种于壳聚糖多孔凝胶中，置于培养基中，使多孔凝胶与培养基的体积比为2:5，在37℃，体积分数5％CO₂的条件下培养，培养3周，每五天分别更换新鲜培养基。

进一步地，所述培养基包含终浓度为3.5mg/L转铁蛋白、5μg/L转化生长因子FGF9、0.15μmol/L地塞米松、2.0mg/L烟酸肌醇酯、0.48mg/L装载有hsa-miR-156a的载体、成纤维细胞生长因子20mg/L、人源化PI3K单抗20mg/L、DMEM培养基和体积分数为8.5％的胎牛血清。

进一步地，所述人源化PI3K单抗为氨基酸序列如SEQ ID NO:01所示的CDR-L1，氨基酸序列如SEQ ID NO:02所示的CDR-L2，氨基酸序列如SEQ ID NO:03所示的CDR-L3，氨基酸序列如SEQ ID NO:04所示的CDR-H1，氨基酸序列如SEQ ID NO:05所示的CDR-H2，氨基酸序列如SEQ ID NO:06所示的CDR-H3。

进一步地，所述抗体选自单克隆抗体、双特异性抗体、特异性结合人PI3K的抗体片段、特异性结合人PI3K抗体片段的融合蛋白、嵌合抗体、人源化抗体和人源化单克隆抗体。