[发明专利]革兰氏阳性菌表达系统在表达腐败梭菌毒素中的应用、腐败梭菌α毒素的制备方法和疫苗

说明书

本发明提供了一种革兰氏阳性菌表达系统在表达腐败梭菌毒素中的应用、腐败梭菌α毒素的制备方法和疫苗，涉及生物技术领域。采用革兰氏阳性菌表达系统表达腐败梭菌毒素实现了腐败梭菌毒素的胞外分泌表达，离心收集上清，就可以获得表达量高且纯度较好的目的蛋白，降低目的蛋白纯化和内毒素去除工艺生产成本。

技术领域

本发明涉及生物制品技术领域，尤其是涉及一种革兰氏阳性菌表达系统在表达腐败梭菌毒素中的应用、腐败梭菌α毒素的制备方法和疫苗。

背景技术

腐败梭菌(Clostridium septium)是一种革兰氏阳性厌氧杆菌，可引起动物和人的恶性水肿病、肌肉坏死、气性坏疽及坏死性肠炎等疾病，也是引发羊快疫的病原菌。

腐败梭菌可分泌α、β和γ等多种外毒素，其中α毒素是其主要致病性毒力因子和免疫保护性抗原。腐败梭菌α毒素是气溶素家族穿孔毒素的一种，是腐败梭菌的主要致死性毒力因子，具有溶血、致死和坏死的作用。腐败梭菌分泌的α毒素具有良好的免疫原性，由其制备的类毒素可有效抵抗腐败梭菌的感染。

目前制备腐败梭菌α毒素疫苗有两种方法。一种是传统菌苗，用腐败梭菌(C55-1株)接种到厌气肉肝汤中厌氧培养24h，提取α毒素，测定毒力后加入甲醛灭活，然后按照一定比例与氢氧化铝佐剂混合制成。传统菌苗中主要活性成分腐败梭菌(C55-1株)采用厌气肉肝汤培养，厌气肉肝汤培养基成分复杂，难于质量控制，导致批间差异大，杂蛋白多；传统菌苗的毒素采用小鼠毒力实验测定，操作复杂且定量结果并不准确；传统菌苗中腐败梭菌(C55-1株)使用甲醛灭活，但是由于腐败梭菌毒性强，因此用于灭活的甲醛用量多，灭活时间长。天然腐败梭菌的α毒素含量较低，需要浓缩10～15倍才能满足疫苗中的抗原含量要求。

另一种腐败梭菌α毒素疫苗为基因工程亚单位疫苗。已有关于腐败梭菌α毒素基因工程疫苗的报道，如一种腐败梭菌α毒素重组亚单位疫苗以及其生产方法(CN107812183A)，一种腐败梭菌α毒素基因及其生产方法(CN109395072A)。这些报道中，均采用IPTG作为诱导剂在大肠杆菌系统中表达，需要检测重组大肠杆菌的生长情况添加诱导剂；α毒素重组蛋白均在胞内表达，需要进行超声破碎及镍柱纯化等复杂的过程。虽然大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、操作简便、生产周期短、表达水平高、成本低和易于大规模培养等优点，是最常用、最经济的外源蛋白表达系统，但是其表达的外源蛋白通常在胞内以不可溶性的包涵体或胞内的可溶性蛋白表达，包涵体不具有生物活性，需进行变性、复性处理；胞内的可溶性蛋白具有生物活性，但含杂蛋白较多，需进行复杂的纯化过程们；由于大肠杆菌是阴性菌，含有大量的LPS(内毒素)，造成疫苗副反应，因此疫苗生产中需要去除内毒素，但是其内毒素的去除工艺复杂，生产成本高，目前是兽用生物制品生产中的难点。因此一种改进的腐败梭菌α毒素的制备方法是目前需要的。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供革兰氏阳性菌表达系统在表达腐败梭菌毒素中的应用，采用革兰氏阳性菌表达系统表达腐败梭菌毒素能够实现腐败梭菌毒素的分泌表达。

本发明的第二目的在于提供一种腐败梭菌α毒素的制备方法，该制备方法实现了腐败梭菌α毒素的胞外分泌表达，离心收集上清，就可以获得表达量高且纯度较好的目的蛋白，降低目的蛋白纯化和内毒素去除工艺生产成本。

本发明的第三目的在于提供上述腐败梭菌α毒素的制备方法的应用。

本发明的第四目的在于提供包含由上述腐败梭菌α毒素的制备方法制备得到的腐败梭菌α毒素的疫苗。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了革兰氏阳性菌表达系统在表达腐败梭菌毒素中的应用。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种腐败梭菌α毒素的制备方法，包括使用革兰氏阳性菌表达系统表达腐败梭菌α毒素。