[发明专利]非人灵长类动物胃饥饿素的检测方法

说明书

本发明公开一种非人灵长类动物胃饥饿素的检测方法，将采集的血样在30s内使用对羟基汞苯甲酸钠作为抑制剂进行处理，以3500g以上4℃离心10min，得到待测血浆，根据双抗夹心ELISA原理建立操作步骤。本发明具备的优点及效果：本方法操作简单，比较稳定，特异性强，且最终结果得到了试剂盒生产商（Bertin Pharma）工程师的认可。由于ghrelin易降解，尤其是acy‑ghrelin，半衰期9‑13分钟，通过确定抑制剂，本发明获得了抑制ghrelin降解的检测方法。

技术领域

本发明涉及一种非人灵长类动物胃饥饿素的检测方法。

背景技术

胃饥饿素Ghrelin是一种胃肠道分泌生成的、由28个氨基酸组成的内源性脑肠肽，具有包括刺激食欲、增加进食量在内的多种生理功能。

目前，小鼠和羊等动物的胃饥饿素检测方法已有公开，而非人灵长类动物因其在系统发育和医学研究方面与人类有近缘优势，是其他啮齿类、非啮齿类实验动物不可比拟的。因此，探索适宜于非人灵长类动物的胃饥饿素检测方法，将为人类肥胖、糖尿病等代谢性疾病及其新药研发提供非常珍贵的NHPs实验依据。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种非人灵长类动物胃饥饿素的检测方法，以实现准确、稳定、简便的检测非人灵长类胃饥饿素。

本发明通过下列技术方案实现：一种非人灵长类动物胃饥饿素的检测方法，经过下列步骤：

（1）将经过动物训练的非人灵长类动物在晚餐后通宵禁食，并于早餐前按常规采集血样；

（2）将步骤（1）采集的血样在30s内使用对羟基汞苯甲酸钠作为抑制剂进行处理，即使用移液枪向血样中加入对羟基汞苯甲酸钠，10ul/ml血样，然后颠倒采血管数次，混匀；

（3）将步骤（2）所得处理后的血样以3500g以上4℃离心10min，得到待测血浆，然后将血浆分装成数管，冻存于-80℃直至检测；

（4）根据双抗夹心ELISA原理建立操作步骤：

a、将试剂盒和待测血浆在室温下静置30分钟；

b、清洗试剂盒中的酶标板板孔；

c、加样：分配标准品、质控品、待测血浆样品；其中，标准品和质控品为试剂盒自带，待测血浆样品为步骤（3）冻存的血浆，空白对照孔为不加任何物的孔；

d、孵育：每孔加入AChE标记物，空白对照孔除外；用封板膜封板，放摇床轻柔振荡使样品混匀，再放室温静置孵育；

e、洗涤：使用洗板机清洗数次酶标板后，在吸水纸上拍干；

f、显色：每孔加入Ellman试剂，放至摇床上（避光），室温孵育；

g、读板：使用酶标仪读取OD值；

（5）根据标准品的OD值及已知浓度绘制标准曲线，最终根据待测血浆样品的OD值来测算出胃饥饿素的浓度。

所述步骤d的室温静置孵育是孵育温度为25℃，孵育时长为3小时。

双抗体夹心ELISA检测原理：

本检测方法基于双抗体夹心技术。酶标板孔内包被有与Ghrelin的C端特异性结合的单克隆抗体。该抗体能结合任何加入孔内的Ghrelin（包括标准品或样品）。加入孔内的追踪物能识别加入孔内的Ghrein的N端。两个抗体通过结合Ghrelin的不同部位从而形成夹心。该夹心被固定在酶标板上，多余的试剂被冲洗掉。加入显色剂，与追踪物结合，形成黄色复合物。Ghrelin的浓度与黄色的深浅成比例。在酶标仪上读取每孔的吸光度，通过标准品吸光度和浓度建立标准曲线，最终通过计算得出Ghrelin浓度。