[发明专利]一种大黄鱼虹彩病毒的双重TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒及制备方法

权利要求书

1.一种大黄鱼虹彩病毒的双重TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含特异性引物和探针，其序列如下：

正向引物F1：5’-CTGAGGGTGGTCGTCTGGTT-3’；

正向引物F2：5’-CAACCACCTGCCGGTTACAG-3’；

反向引物R1：5’-ATGGCGACCCTGCTACTTCT-3’；

反向引物R2：5’-GTGACGGTGGAATAGCAGGC-3’；

荧光探针Q1：5’-AAGGTGGTGGCGTGAGTACACGCCA-3’；

荧光探针Q2：5’-CCGGCACCACCTTACCAGCCGCCTGCT-3’；

所述荧光探针Q1的5’端标记6-FAM荧光基团，3’端标记能够淬灭荧光基团荧光信号的淬灭基团BHQ1；

荧光探针Q2的5’端标记VIC荧光基团， 3’端标记能够淬灭荧光基团荧光信号的淬灭基团BHQ1。

2.一种如权利要求1所述试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备盒体；

（2）配制检测试剂：

裂解液的配方为：终浓度5mol/L盐酸胍，0.1mol/L EDTA，去离子水定容至1L，pH为8.0；

吸附液的组成为玻璃粉、浓硝酸与水，所述玻璃粉、浓硝酸与水的配比为1g：5~6 mL：10~12 mL，所述浓硝酸的质量分数为55%-70%；

洗涤液的配方为：终浓度0.1mol/L 氯化钠，1mmol/L EDTA，10mmol/L Tris-HCl，去离子水定容至1L，pH为7.5，再加入等体积的无水乙醇；

荧光定量PCR反应液的配方为：每19μL中包含2×定量PCR预混液10μL，正向引物F1 0.4μL，F2 0.4μL，反向引物R1 0.4μL，R2 0.4μL，荧光探针Q1 0.2μL，荧光探针Q2 0.6μL，双蒸水6.6μL；

阳性对照为DNA拷贝数比1:1的pMD18-T-LYCIV-ORF021R和pMD18-T-LYCIV-ORF129R的混合溶液；

阴性对照为无菌水；

（3）将裂解液、吸附液、洗涤液、操作说明书、荧光定量PCR反应液、阴性对照、阳性对照置入盒体内，即得到大黄鱼虹彩病毒的双重TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述阳性对照的制备方法为：

1）引物设计，具体方法为：

根据已公开的大黄鱼虹彩病毒基因组序列，采用Primer Premier 5设计能特异性鉴别大黄鱼虹彩病毒的正向引物F1、F2和反向引物R1、R2：

正向引物F1：5’-CTGAGGGTGGTCGTCTGGTT-3’；

正向引物F2：5’-CAACCACCTGCCGGTTACAG-3’；

反向引物R1：5’-ATGGCGACCCTGCTACTTCT-3’；

反向引物R2：5’-GTGACGGTGGAATAGCAGGC-3’；

2）重组质粒pMD18-T-LYCIV-ORF021R或pMD18-T-LYCIV-ORF129R的构建步骤为：

使用大黄鱼虹彩病毒特异检测引物，以大黄鱼虹彩病毒检测阳性的大黄鱼内脏组织样品DNA为模板，经过PCR反应，获得一段98 bp或103 bp的ORF021R或ORF129R基因片段，然后将PCR产物电泳目的条带使用Gel Extraction Kit切胶回收并连接到pMD18-T载体上，转化至Trans1-T1 Phage Resistant化学感受态细胞中，筛选阳性克隆并测序验证；

3）阳性对照的制备

提取构建好的pMD18-T-LYCIV-ORF021R或pMD18-T-LYCIV-ORF129R质粒，用分光光度计检测质粒的质量和浓度，按照如下公式计算出目的基因的拷贝数，然后用灭菌超纯水稀释成浓度为1×10⁸拷贝/μL；将2种含相同拷贝数的质粒溶液1:1混匀，即为阳性对照；将该阳性对照稀释到1×10⁷拷贝/μL后继续做10倍系列稀释，得1×10⁶-1×10²拷贝/μL质粒，用于制作标准曲线：

。

4.一种利用权利要求1所述试剂盒判定大黄鱼虹彩病毒的方法，其特征在于，以标准曲线中Ct值大小判断病毒的有无；阴性对照应无Ct值，阳性对照Ct值35，且出现S型典型扩增曲线；待测样品Ct值≤35且出现典型扩增曲线，可判定为阳性；若待测样品无扩增曲线，或Ct值35，可判定为阴性。