[发明专利]一种延丹胶囊在制备治疗心肌缺血药物中的应用

权利要求书

1.延丹胶囊在制备治疗心肌缺血药物中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于：所述延丹胶囊可治疗由心肌缺血所引起的疾病包括心律失常、心肌梗死、冠心病。

3.根据权利要求1所述应用，其特征在于：所述应用包括对延丹胶囊抗心肌缺血药效的验证方法，包括如下步骤：

首先：对延丹胶囊对异丙肾上腺素诱导大鼠心肌缺血的作用及机制进行验证：

1.材料准备；

1.1药物和试剂：延丹胶囊；通心络胶囊；盐酸异丙肾上腺素；生理盐水注射液；水合氯醛；甲醛；MDA、T-SOD、AST检测试剂盒；HIF-1α检测试剂盒；IL-1β(批号E20191001A)、TNF-α检测试剂盒；Nrf2抗体；HO-1抗体；p53抗体；Bcl-2抗体；Bax抗体；GAPDH抗体；

1.2动物：SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，体重200±20g，大鼠在标准实验条件下，温度25±2℃，相对湿度60±5％适应性饲养1周后，进行随机分组，同时给予正常昼夜节律，提供自由饮水和进食；

1.3仪器：BL-420N生物信号采集与分析系统；分析天平；全波长酶标仪；KD-BM生物组织包埋机；Leica RM2235切片机；正置生物显微镜BX53；EPS600电泳仪；Western blot转膜仪；全自动数码凝胶/化学发光图像分析系统；

2方法：

2.1造模及给药：将60只SD大鼠，雌雄各半，随机分成空白组，模型组，通心络胶囊组，剂量为200.57mg/kg，延丹胶囊低、中、高剂量组，剂量为154、308、616mg/kg，其中，延丹胶囊中剂量为临床用量，人与大鼠等效剂量换算比例为1:6，SD大鼠连续灌胃给药8d，给药容积为1ml/100g，空白组和模型组给予等量的生理盐水，第6-8天，灌胃给药30min后，除空白组外，其余组大鼠腹腔注射ISO 40mg/kg，连续注射3d，空白组注射等量的生理盐水，用于构建急性心肌缺血模型；

2.2心肌缺血大鼠心电图监测：第6天灌胃给药30mim后，10％水合氯醛麻醉各组大鼠，等大鼠进入麻醉状态后，腹腔注射ISO，40mg/kg，并对大鼠立即进行肢体Ⅱ导联心电图检查，记录ST段的变化；

2.3血清因子检测：第8天，灌胃给药30min后，经大鼠腹部正中线切开，打开腹腔，腹主动脉采血至无菌试管内，静置30min，3000r/min离心15min，分离血清后测定其中MDA、T-SOD、AST、HIF-1α、TNF-α和IL-1β水平，按照各试剂盒说明书中的方法进行操作，利用全波长酶标仪检测；

2.4心肌组织病理学检查：第8天，灌胃给药30min后，经大鼠腹部正中线切开，打开胸腔，取下心脏，选取左心室组织，置于装有10％甲醛溶液的离心管中固定48h，采用HE染色法观察心肌组织的病理变化；

2.5Western Blotting：称取200mg心肌组织，加入液氮后在研钵中充分研磨，加入裂解液充分混匀，冰上裂解30min，4℃，12 000r/min离心30min，取上清；BCA试剂盒进行蛋白定量，调整蛋白浓度；蛋白变性后，上样、电泳、转膜；加入一抗4℃下孵育过夜，TBST清洗后加入二抗，室温孵育2h，TBST清洗，加入ECL发光液进行曝光，扫描图像后利用Image J软件分析实验结果，目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值的比值为目的蛋白的相对含量；

2.6免疫组化：每组中取3只大鼠心脏用10％福尔马林进行固定,经脱水、石蜡包埋,常规切片4μm，再依次进行脱蜡，水化，抗原修复，一抗孵育，二抗孵育，苏木精核染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，晾干，显微镜下对左心室心肌细胞进行观察并拍照，利用Image J软件对图片进行阳性细胞率统计；

2.7统计学分析：除心电图实验结果采用t检验外，其余数据均采用单因素方差分析，用x±SEM表示，统计软件为GraphPad Prism 5.01，P0.05被认为有统计学差异；

3结果分析：通过观察心肌缺血大鼠心电图ST段的变化、心肌组织病理变化，以及MDA、AST及炎症因子等指标水平的变化，可以发现延丹胶囊能否有效的降低急性心肌缺血大鼠ST段异常抬高，减轻心肌组织的病理损伤程度，显著降低大鼠血清中MDA、AST、HIF-1α和TNF-α水平，显著升高T-SOD水平，据此判断延丹胶囊对异丙肾上腺素致SD大鼠急性心肌缺血损伤是否具有良好的保护作用。