[发明专利]直接力学响应细胞亚群的筛选方法及其应用

权利要求书

1.直接力学响应细胞亚群的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

a. 利用Cre-loxP系统构建成骨细胞系特异荧光表达小鼠，并建立体内应力加载模型，所述成骨细胞系为牙槽骨成骨细胞系；

构建荧光表达小鼠的方法为：通过成骨细胞特异表达的Osx-Cre小鼠与R26^tdTomato小鼠经过交配可获得条件性荧光小鼠R26^tdTomato,Osx-Cre；

b. 利用流式分选获得tdTomato阳性表达加力组和对照组骨组织单细胞悬液；

c. 单细胞分选、文库构建、高通量测序及数据分析，构建成骨系细胞分群图谱及拟时序细胞分化路径；

所述数据分析包括RdsPlot分析、拟时序分析、基因功能分析、SCENIC、QuSAGE分析、细胞通讯分析和ScGeneModule分析；

d. 比较加力组及对照组细胞分群比例及拟时序分析，筛选主要发生占比及拟时序变化的细胞亚群；

e. 体外验证，即通过候选群体的标记基因所编码膜蛋白进行流式分选，体外培养该亚群，并进行体外应力加载；

体外验证的具体步骤包括：

（1）WT小鼠酶消化法得骨组织细胞；

（2）体外培养步骤（1）制得的细胞；

（3）检测干细胞特性：包括成骨向分化检测、碱性磷酸酶酶化学染色检测和茜素红染色检测；

（4）体外应力加载检测力学响应性；

f. 体内验证，即通过构建候选群体的标记基因启动子所驱动的CreER小鼠进行谱系示踪及细胞剔除验证，具体步骤如下所示：

（1）通过CRISPR/Cas9技术对候选标记基因进行修饰，在其终止密码子前插入P2A-Cre^ERT2，获得他莫昔芬诱导的诱导型条件性Cre表达小鼠模型，构建候选群体的标记基因启动子所驱动的CreER小鼠；

（2）构建诱导型条件性荧光表达小鼠模型：标记基因-Cre^ERT2小鼠与R26^tdTomato小鼠经过一代杂交获得诱导型条件性荧光表达小鼠；

（3）构建诱导型细胞剔除小鼠模型：标记基因-Cre^ERT2和R26^DTA Rosa26-loxP-STOP-loxP-DTR小鼠交配，获得细胞剔除模型小鼠；

（4）利用诱导型条件性荧光表达小鼠构建体内应力加载模型，通过谱系示踪分析候选细胞亚群的成骨向命运决定及谱系发生，并分析应力作用下该细胞亚群成骨向命运决定及谱系发生的改变，阐明其直接力学响应性；

（5）利用诱导型细胞剔除小鼠构建体内应力加载模型，分析候选细胞亚群剔除后骨改建速度、牙槽骨微结构参数及骨代谢参数的改变。

2.采用权利要求1所述的筛选方法获得的直接力学响应细胞亚群，其特征在于，包括Fat4+亚群、Fgfr3+亚群和Scara5+亚群。