[发明专利]一种胞磷胆碱钠的合成方法

说明书

本发明公开了一种胞磷胆碱钠的合成方法，包括以下步骤：向反应容器中加入5'‑胞苷酸，氯化磷酸胆碱钙盐，ATP，氯化镁水溶液，Tris‑HCl缓冲液，混合均匀；接着，调节pH值至6.0～8.0，并加入CMP磷酸激酶、核苷二磷酸激酶和磷酸胆碱‑胞苷酰转移酶，在25～50℃下搅拌反应4～10小时，高速离心后，取上清液，即得所述胞磷胆碱钠；与传统的胞磷胆碱钠合成工艺相比，本发明提供的合成路线对环境友好，产率稳定，有利于节省能耗和保护环境，因此适用于大规模工业化生产。

技术领域

本发明涉及酶催化技术领域，具体涉及一种胞磷胆碱钠的合成方法。

背景技术

胞磷胆碱钠又称胞二磷胆碱钠，是一种脑代谢激活剂，其为核苷衍生物，是磷酯酰胆碱的前体物质，也是卵磷脂合成所必需的辅酶。研究表明，胞磷胆碱钠具有修复脑损伤，抗缺氧，改善记忆，增强智力的作用，临床应用较广。

因此，胞磷胆碱钠的制备方法是研究人员比较关心的研究课题。

现有技术中，制备胞磷胆碱钠的方法包括：

①化学合成法：利用CMP(5'-胞苷酸)和磷酸胆碱作为反应物，对甲苯磺酰氯为缩合剂，在N-二甲基甲酰胺(DMF)存在下缩合成胞磷胆碱钠，然而，化学合成存在反应转化率低，副产物多，生产成本高，环境污染严重等问题。

②微生物发酵法：用酵母菌或产氨短杆菌等微生物利用葡萄糖，并添加CMP、CP等前提物发酵生成胞磷胆碱钠，但是微生物发酵法存在产物浓度低，产率不稳定等问题。

③酶促合成法：抽提细胞液用胞苷三磷酸(CTP)和磷酸胆碱生物合成胞磷胆碱钠，但是，现有的酶和细胞液合成需要使用底物CTP，从而造成合成成本较高。

因此，亟需提供一种适于大规模工业化生产的胞磷胆碱钠的制备方法，以解决酶来源受限制和合成成本过高的技术问题。

发明内容

针对现有技术中存在的种种技术缺陷，本发明旨在提供胞磷胆碱钠的新制备方法，其以大肠杆菌表达的游离酶为生物催化剂，以5'-胞苷酸、磷酸胆碱、ATP为反应原料进行生物转化，成功制得了目标产物；同时，本发明提供的技术方案还解决了酶来源受限制和合成成本过高的技术问题。

同时，本发明提供了一条新的胞磷胆碱钠的合成路线，如下所示：

具体地，一种胞磷胆碱钠的合成方法，其包括以下步骤：

向反应容器中加入5'-胞苷酸，氯化磷酸胆碱钙盐，ATP，氯化镁水溶液，Tris-HCl缓冲液，混合均匀；接着，调节pH值至6.0～8.0，并加入CMP磷酸激酶、核苷二磷酸激酶和磷酸胆碱-胞苷酰转移酶，在25～50℃下搅拌反应4～10小时，高速离心后，取上清液，即得所述胞磷胆碱钠；

其中，所述CMP磷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述核苷二磷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述磷酸胆碱-胞苷酰转移酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示；详见下表1：

表1氨基酸序列表

优选地，在上述胞磷胆碱钠的合成方法中，在反应体系中，所述CMP磷酸激酶、所述核苷二磷酸激酶和所述磷酸胆碱-胞苷酰转移酶的浓度分别为1～50g/L。

优选地，在上述胞磷胆碱钠的合成方法中，在反应体系中，所述5'-胞苷酸的浓度为5～150mmol/L。

优选地，在上述胞磷胆碱钠的合成方法中，在反应体系中，所述氯化磷酸胆碱钙盐的浓度为15～200mmol/L。