[发明专利]一种多能干细胞定向分化为功能性心肌的方法

说明书

本发明涉及一种用于从多能干细胞中生产生物工程化心肌(BHM)的方法，所述方法通常包括，通过定向组织形成，诱导中胚层分化、心肌分化和心肌成熟的步骤。该方法是一种稳健的、无血清的且可再生的生产用于多种应用的BHM的途径，并且可应用于多种多能干细胞系。本发明还涉及通过本文公开的方法生产的BHM，以及所述BHM在药物和毒性筛选中的用途，和其在医药中的用途。

背景技术

如今人多能干细胞(hPSC)广泛地用于提供理论上无限的且同时大量供应的人心肌细胞(Kehat等，J Clin Invest 108,407-414(2001)；Takahashi等，Cell 131,861-872(2007)；Zhang等，Circ Res 104,e30-41(2009))。人心肌细胞源自人胚胎干细胞(hESC)(Thomson等，Science 282,1145-1147(1998))和诱导多功能干细胞(hIPSC)(Takahashi等，Cell 131,861-872(2007))，并且人心肌细胞具有包括发育模型(Lian等，Stem Cells 2012(2012))、药物疗效和/或安全性筛选(Schaaf等，PLoS ONE 6,20(2011))、肥厚建模和再生应用的已证明的多目的用途。此外，对于hIPSC技术的最新进展，可以在体外产生显示遗传性基因疾病表型的心肌细胞(Carvajal-Vergara,X.等，Nature465,808-812(2010)；Itzhaki等，Nature 471,225-229(2011)；Malan等，Circ Res(2011)；Moretti等，N Engl JMed 363,1397-1409(2010)；Yazawa等，Nature 471,230-234(2010))。

目前普遍认为，源自活检的人心肌细胞的低密度2D培养会导致心肌细胞表型和形态的快速改变(Bird等，Cardiovasc Res 58,423-434(2003))，从而使其体内状况结果的推断变得困难。为了获得更能代表体内条件的心肌细胞表型，采用心肌组织工程(Eschenhagen等，FASEB J 11,683-694(1997)；Zimmermann等，Biotechnol Bioeng 68,106-114(2000)，Zimmermann等，Circ Res 90,223-230(2002)；Tulloch等，Circ Res 109,47-59(2011)；Tiburcy等，Circ Res 109,1105-1114(2011)；Eschenhagen等，Am J PhysiolHeart Circ Physiol 303,11(2012))来产生与自然的心肌组织具有类似性质的构建体。

组织工程目前的观念学是产生/分离所需的一种或多种细胞类型，并将这些细胞类型接种于工程化的环境中从而促进其分化并产生体内样组织。因此，组织工程可被认为是一个低效过程的原因有两个：1)组织/分化培养物的分离破坏了胞外环境，从而破坏发育信息(如细胞-细胞的互联性、几何细胞定位、细胞-ECM的连通性)，为了重新建立环境，需要细胞外基质(ECM)生产的大量增加(Hudson等，Tissue Eng Part A 17,2279-2289(2011))；和2)hPSC细胞系间的分离过程是可变的，并能导致大量的细胞死亡。

文献中报道的其它试验方案可能需要对试验方案进行修改从而实现多个hPSC细胞系中相似的心肌细胞效率。然而，发明人得到的结果证明分化试验方案的改变可极大地影响心肌细胞的表型(如证明dorsomorphin可极大地影响生物工程化心肌(BHM))。这可导致组织工程化心肌性能改变，从而可掩盖不同实验条件或遗传性疾病模型的效果，因此当在不同细胞系中应用不同试验方案时必须小心。

一些近期公开的试验方案实现了将相同的试验方案应用于多个细胞系，它们还能产生高纯度的心肌细胞。然而，纯的心肌细胞不能促进功能性组织工程化心肌的形成，并且功能性组织工程化心肌的形成需要心肌细胞和基质细胞两者(Naito等，Circulation 114,I72-78(2006)，Hudson等.Tissue Eng Part A 17,2279-2289(2011))。