[发明专利]N-DMV和N-DHCLV双重实时荧光定量PCR鉴别检测引物及试剂盒

说明书

本发明提供N‑DMV和N‑DHCLV双重实时荧光定量PCR鉴别检测引物及试剂盒，引物序列如SEQ ID NO.1‑4所示，具有很高的特异性和灵敏度。建立的方法能够同时对鸭群中N‑DMV和N‑DHCLV流行病学情况及感染程度进行检测，简化操作程序、节约成本。实时荧光定量PCR反应结束后，通过观察扩增曲线和Tm值即可直接对结果进行判断。本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

技术领域

本发明提供新型鸭源Megri病毒（N-DMV）和新型鸭源类丙肝样病毒（N-DHCLV）双重实时荧光定量PCR检测引物及试剂盒，属于动物传染病学领域。

背景技术

实时荧光定量PCR方法（Real time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参（或者外参法）对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。实时荧光定量PCR技术在检测病原时不仅可以定性检测病原的有无，而且还可以定量分析病毒含量的多少，在病原核酸检测技术上被广泛使用。双重实时荧光定量PCR是一种特殊的荧光定量PCR形式，其突出的特点是一次实时荧光定量PCR反应可同时检测两种病原，对病原复杂或存在多种基因型的病原鉴别检测十分有效。

微核糖核酸科（Picornaviridae）病毒是一类呈球形、无囊膜的单股正链病毒，其病毒颗粒直径约20-30nm。前期基因组学研究发现微核糖核酸科病毒长度一般为6.6kb-9.8kb。典型的微核糖核酸科病毒的基因组一般仅含有一个大的开放阅读框（open readingframe，ORF），其两侧分别是5’-UTR和3’-UTR。目前，已见有火鸡源、鸡源、鸽源和鸭源微核糖核酸科Megrivirus属（中文名暂未确定）成员被发现。对新型鸭源Megri病毒（novel duckmegrivirus, N-DMV）新型鸭源Megri病毒（novel duck megrivirus, N-DMV）（Liao Q，等.Genomic characterization of a novel picornavirus in Pekin ducks. 2014，172(1-2):78-91. doi: 10.1016/j.vetmic.2014.05.002.）基因组分析发现N-DMV具有类似于Megrivirus属病毒的基因组结构，其聚蛋白含有典型微核糖核酸科病毒的特征性基序，但亦有自身的特点。不计poly(A)尾，N-DMV基因组长度为9700bp，是微病毒科中最长的。最显著的特点位于2A区，该区由两个功能未知的蛋白（2A1、2A2）和以及一个parachovirus样2A3组成。研究还发现，N-DMV具有和火鸡源、鸡源、鸽源Megri病毒相似的基因组结构特征，且在遗传进化上处于同一遗传进化分支。