[发明专利]一种N-DHCLV实时荧光定量PCR检测引物及试剂盒

说明书

本发明涉及一种N‑DHCLV实时荧光定量PCR检测引物及试剂盒，属于动物传染病学领域。本发明包括特异性引物和探针序列的设计、标准质粒的构建、实时荧光定量PCR扩增方法的建立和优化及结果检测判定。本发明利用所述引物和探针建立的检测N‑DHCLV的实时荧光定量PCR方法，在检测N‑DHCLV上灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，最低可检测55.93个拷贝，可用于检测临床样本中N‑DHCLV的感染检测。

技术领域

本发明涉及一种N-DHCLV实时荧光定量PCR检测引物及试剂盒，属于动物传染病学领域。

背景技术

实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标（molecular Beacon）。TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC、JOE等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如Eclipse、TAMRA、BHQ1等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’ 荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光)。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。

黄病毒科（Flaviviridae Family）是一个基因组为单股正链 RNA 的小包膜病毒科，其中大多数病毒感染哺乳动物和鸟类，且许多病毒具有宿主特异性和致病性。基于RdRP 保守区域氨基酸序列的系统发育关系表明，黄病毒科成员聚集在当前指定的4个病毒属中，包括黄病毒属（Flavivirus genus）、瘟病毒属（Pestivirus genus）、丙型肝炎病毒属（Hepacivirus genus）、佩吉病毒属（Pegivirus genus）。其中，塔玛纳蝙蝠病毒（Tamana bat virus）分配于一独立的分支，暂被列为黄病毒属（Flavivirus）的一个潜在成员。近年来，随着高通量测序和血清学方法的广泛应用，不少研究者在不同哺乳动物中发现了多种新型HCV同源病毒（HCV样病毒）。新型鸭源类丙肝样病毒（novel duck hepacivirus-like，N-DHCLV）（Chu L，等. A highly divergent hepacivirus-like flavivirus in domesticducks. J Gen Virol. 2019, 100(8):1234-1240. doi: 10.1099/jgv.0.001298.）是近年来从产蛋遗传鸭群中发现的新发现HCV同源病毒（HCV样病毒）。基因组学研究发现，其基因组为单股正链RNA，基因组长为11422bp，编码一个长度为10824bp的开放阅读框（openreading frame，ORF），编码的多聚蛋白长为3607个氨基酸。遗传进化分析表明，其属于类丙肝样病毒属成员。