[发明专利]一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用，所述免疫细胞表达嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括DAP10和信号传导结构域，所述信号传导结构域连接在所述DAP10的C端；所述DAP10为所述嵌合抗原受体的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域；所述嵌合抗原受体还包括抗原结合结构域，所述抗原结合结构域连接在所述DAP10的N端。本发明的嵌合抗原受体对特异性肿瘤细胞和异质性肿瘤细胞均具有靶向作用，构建的表达嵌合抗原受体的免疫细胞在靶向表达特异性抗原的肿瘤细胞的同时，还调动内源NKG2D的功能，靶向具有异质性的肿瘤细胞，实现对特异性肿瘤细胞和异质性肿瘤细胞的清除杀伤作用。

技术领域

本发明属于细胞免疫治疗技术领域，涉及一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞亦称为CAR-T细胞，是利用基因工程技术将特异性识别抗原的单链可变区(scFv)与T细胞共刺激和激活信号(如CD28、4-1BB、OX40、CD3ζ等)相串联，表达于T细胞上，从而赋予T细胞特异性识别靶标蛋白的功能，并针对表达靶标蛋白的细胞产生杀伤作用。将制备好的CAR-T细胞回输到肿瘤患者体内，通过发挥CAR-T细胞靶向特定肿瘤抗原的功效，从而达到消除肿瘤细胞的目的。目前，使用靶向CD19的CAR-T细胞治疗白血病已经获得了良好的疗效，细胞疗法在肿瘤治疗领域展现出广阔的前景。针对实体瘤GPC3、Mesothelin和Muc1等靶标，研究人员设计了相应的CAR-T细胞，以期望将CAR-T细胞疗法应用于实体肿瘤治疗。

尽管CAR-T细胞可以靶向表达特异性抗原的肿瘤细胞，但是很多肿瘤细胞并不表达专一、特异的肿瘤抗原，肿瘤异质性是细胞疗法治疗实体肿瘤面临的一大障碍。增加嵌合抗原受体分子识别不同靶标的能力是解决以上问题的方案之一，例如可以借鉴固有免疫中的识别广谱抗原蛋白的受体构建CAR-T细胞，从而增强传统CAR-T细胞对无特异性抗原表达肿瘤的识别能力。

NK细胞具有快速发现和清除癌变或被病毒感染的细胞的功能，这一过程不需要抗原呈递细胞的介导，而是依赖一系列NK细胞激活受体的活化，如NKG2D、NKp30、NKp46和DNAM1等。目前，已经发现的可被NKG2D(natural-killer group 2，member D)受体识别的人源抗原有8个，包括MICA/B和ULBP家族。作为细胞压力应激分子，这些抗原在正常组织细胞中的表达量很低，只有当细胞发生癌变或受到感染时才会表达上调，向NK细胞提供识别和清除病变细胞的信号。NKG2D受体表达于NK细胞中，激活后的CD8αβT细胞和γδT细胞。NKG2D受体本身没有胞内信号转导域，需要借助转接分子DAP10向细胞传递激活信号。DAP10作为I型膜蛋白，与NKG2D形成二聚体后，通过招募PI3K激酶的p85亚基和Grb2-Vav1复合物，向下游传递信号。目前，已有将NKG2D胞外段同传统CAR分子信号转导域相结合的技术方案，构建得到靶向多种抗原的嵌合抗原受体T细胞或NK细胞。但是该技术仅能靶向NKG2D可识别的抗原，受病毒载体载量限制无法添加更多的功能元件，无法近一步丰富CAR-T或CAR-NK细胞的功能。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用，通过使用小片段编码基因构建表达CAR分子的免疫细胞，使得免疫细胞在靶向特异性肿瘤相关抗原的同时，兼顾识别和清除异质性肿瘤，所述基因修饰的免疫细胞针对肿瘤特异性抗原表达量少、但是表达一定NKG2D配体的肿瘤具有显著的治疗效果。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括DAP10蛋白和信号传导结构域，所述信号传导结构域连接在所述DAP10蛋白的C端；

所述DAP10蛋白为所述嵌合抗原受体的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。