[发明专利]博落回八氢番茄红素脱氢酶基因的核苷酸序列及应用

说明书

本发明提供一种博落回八氢番茄红素脱氢酶基因的核苷酸序列及应用，所述博落回八氢番茄红素脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明还提供了一种博落回八氢番茄红素脱氢酶的氨基酸序列，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。通过引物设计及PCR扩增的方法获得了博落回八氢番茄红素脱氢酶基因，并将其应用于基于CRISPR/Cas9的博落回基因的构建体系，为首次在博落回植物中实现基因编辑，为博落回中功能基因挖掘、种质创新等提供有力途径。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及博落回八氢番茄红素脱氢酶基因的核苷酸序列及应用。

背景技术

博落回(Macleaya cordata(Willd.)R.Br)是一种重要的药用植物，通过研究，目前已成功开发了“博落回提取物”、“博普总碱”两个二类中兽药新药产品，作为饲用抗生素的天然来源替代品广泛用于畜禽水产等养殖业中，随着我国《全国遏制动物源细菌耐药行动计划(2017-2020年)》计划的实施，目前已经全面禁止饲用抗生素的添加，而由博落回开发的系列替抗产品优势逐渐凸显，但是，博落回资源非常有限，若能结合现代分子育种技术对博落回进行定向改良，将为快速获得优质博落回种质提供途径，因此，发展一种针对博落回的CRISPR/Cas体系，并将其应用在博落回基因修饰及种质创新领域显得尤为重要。

对基因进行定点修饰，是生物研究领域重要的方法之一。随着科学的发展，越来越多的沉默技术发展迅速。从经典的MES随机诱变，T-DNA或转座子插入失活到锌指结构(ZFs)与转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases，TALENs)定点突变，这些技术都大大促进了研究基因功能的进程。但由于锌指核糖核酸酶(ZFN)与转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)技术需要针对每一个目的基因设计特定的内切酶，且构建过程繁琐，大大限制了其应用范围。与其他沉默体系相比，CRISPR定点突变技术有其无法比拟的优点，逐渐被广泛地应用与基因定点修饰研究中。

CRISPR/Cas系统(clustered，regularly interspaced，short palindromicrepeats-associated protein systems)最早是在大肠杆菌中发现的，是细菌针对噬菌体等外源DNA的获得性免疫系统，该系统主要依赖于crRNA与Cas蛋白形成的核糖核蛋白复合物识别靶序列上的PAM结构，进而对入侵噬菌体或质粒进行特异性切割。CRISPR系统主要有三种类型,其中II型体系仅需要一个Cas9蛋白、crRNA与tracrRNA就能行使其功能。有研究表明将crRNA与tracrRNA整合成sgRNA并不影响CRISPR/Cas9体系的作用。2013年8月，自然生物技术期刊上首次同时发表了三篇有关CRISPR/Cas9体系成功应用于植物基因修饰的研究。之后，CRISPR/Cas9体系被广泛地应用于拟南芥、烟草、水稻、高粱等模式植物及作物研究上，但CRISPR/Cas9体系在植物药材中的应用还非常少。

PDS基因是八氢番茄红素脱氢酶基因的简称，八氢番茄红素脱氢酶参与催化无色的八氢番茄红素转变成有色类胡萝卜素，是调控叶片白化的关键基因。目前已经使用CRISPR/Cas9技术编辑甘蓝、苹果、香蕉、菠萝等物种中的PDS基因，并成功编辑获得白化植株，但在博落回的研究上则是一片空白。

发明内容

为了克服现有技术中的问题，本申请提供一种博落回八氢番茄红素脱氢酶基因的核苷酸序列及应用，为研究博落回以及博落回八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因提供了基础。

为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

本发明第一方面提供了一种博落回八氢番茄红素脱氢酶基因的核苷酸序列，所述博落回八氢番茄红素脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一个优选的实施方案中，所述核苷酸序列利用如下所示的引物通过PCR扩增获得，