[发明专利]基于核酸自我催化的逻辑环路及其应用

说明书

基于核酸自我催化的逻辑环路及其应用，由5条核酸单链组成，所述核酸单链为B、C、D、E链和目标检测链A；反应起始时：B链和C链杂交，D链和E链杂交；加入目标检测A链后，形成一个闭合的反应环路：A置换C链并和B链杂交生成AB产物，C置换E链并和D链杂交生成CD产物，E置换C链并和B链杂交生成EB产物。本发明将描述新的基于熵驱动催化的核酸自我扩增的逻辑环路，显著提高了基于熵驱动催化的核酸扩增的效率，可用于临床RNA的检测。

技术领域

本发明属于核酸检测领域，具体涉及一种基于熵驱动催化的核酸自我扩增的逻辑环路及其应用。

背景技术

目前，临床核酸检测主要基于PCR/分子杂交和测序技术发展而来，这两类技术对仪器和样品要求较高，尤其是临床常用的PCR/分子杂交技术要求在超净台中完成，试剂和操作环节复杂，要求在精密的PCR仪中完成，不利于大规模应用。

熵驱动催化（entropy-driven catalysis，EDC）是近年来发展起来的将核酸的链置换技术与DNA程序化自组装结合起来的一种能部分移动或者随时间变化动态非酶催化核酸纳米技术。从朗讯公司贝尔实验室的Bernard Yurke发现了核酸链置换现象到后来加州理工学院Erik Winfree等人基于该反应设计出多种程序化的级联瀑布式反应，该方法已被广泛应用于各种核酸相关的纳米技术领域，如核酸传感器、核酸计算机等。通过借助计算机辅助计算，对反应的核酸链的碱基序列进行精心得设计，该反应体系可按照预先设计的反应顺序进行程序化反应，且该方法显示出极高的特异性，对核酸的单碱基错配显示出极高的敏感。基于此特性，使用EDC技术对核酸进行扩增可以获得极高的特异度，满足临床对诊断实验的要求。

基于支点的链置换（Toehold mediated strand displacement），是一种基于熵驱动催化的核酸单链之间的竞争结合反应，其反应过程主要决定于反应过程中的吉布斯自由能变，无需任何酶催化反应。根据反映前后是否会产生新的Toehold，可以将链置换反应分为两类：Toehold介导的链置换反应（Toehold mediated strand displacement）以及Toehold介导的链交换反应（Toehold exchange）。因反应后不产生新的toehold，toeholddisplacement易于发生，其反应的吉布斯自由能远小于toehold exchange反应。但是toehold exchange反应因其反应自由能接近于零，表现出对toehold区碱基错配的极高特异性，因此选用toehold exchange反应可满足核酸检测中对特异度的高要求。近年来，链置换反应结合其他不同的检测方法用于各种检测方法、生物传感器的构建等方面已有大量研究。同时，该方法是一种等温环境中进行的核酸扩增反应，因此无需昂贵的实时荧光定量PCR仪，仅靠简单的恒温设备即可使得反应进行；因反应体系无需酶促，试剂盒成本低廉，且省去了相应的存储、运输过程中的冷链成本。

但是，该技术存在着反应扩增倍数不足的缺陷。据相关研究报道，通过不同的设计，在一小时等温扩增后可扩增十到近千倍，这与聚合酶链式反应的指数级扩增还有较大差距，导致其灵敏度不够，易产生假阴性假阳性。本发明所述方法基于熵驱动催化可以实现核酸的高效扩增，提高方法灵敏度，并减少了检测时间，在核酸检测中有显著应用意义。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种基于核酸自我催化的逻辑环路及其应用，可以极大提高基于支点的链置换技术的信号扩增效率，本方法可以应用于临床、科研和制药领域。

技术方案：基于核酸自我催化的逻辑环路，由5条核酸单链组成，所述核酸单链为B、C、D、E链和目标检测链A；反应起始时：B链和C链杂交，D链和E链杂交；加入目标检测A链后，形成一个闭合的反应环路：A置换C链并和B链杂交生成AB产物，C置换E链并和D链杂交生成CD产物，E置换C链并和B链杂交生成EB产物。