[发明专利]荧光定量熔解实验中熔解曲线测量方法

说明书

本发明提供了一种荧光定量熔解实验中熔解曲线测量方法，涉及荧光定量检测技术领域，包括采集荧光定量熔解实验中非等间隔荧光强度数据；确定滑动窗口大小以及多项式次数；对各滑动窗口内荧光强度数据按照多项式次数对应的多项式进行拟合，确定导数矩阵；基于导数矩阵，计算滑动窗口内各采样点对应的负导数数据，获得平滑后的熔解曲线。以此可以降低拟合、平滑、插值的过多引入，减小误差，并且计算复杂度低。

技术领域

本发明涉及荧光定量检测技术领域，尤其是涉及一种荧光定量熔解实验中熔解曲线测量方法。

背景技术

目前，诊断传染病标准的核酸定量方法仍主要采用荧光实时定量PCR，其能够量化样品模板的初始值，常被用在基因分析表达、转基因食物检测和癌症检测中。在PCR扩增反应完成后，常通过逐渐增加温度、使扩增产物发生降解来获得荧光强度变化值即熔解曲线，从而对扩增产物的特异性进行考察。可见，要获得熔解曲线，需要获得荧光强度的变化情况，即求取荧光强度的导数。

对于分辨率较高、采样点数多且等间隔的荧光强度值，直接差分法与实际相差不大，唯一需要解决的问题是如何消除差分带来的噪声，通常的方法有两种：其一是在差分之前对原始强度数据进行平滑，这种方法最早由Norris等人提出，常称为Norris求导法，当然也可采用其他的平滑如Savitzky-Golay平滑方法等；其二是在直接差分之后再进行平滑滤波。

但对于分辨滤较低、采样点数较少，特别是不等间隔数据(注：为了节约时间，在做熔解实验时，得到的随温度变化的荧光强度数据常常是不等距的)，直接差分法误差较大。此时，通常的做法是对非等间隔采样数据进行曲线拟合，然后再进行均匀上采样插值，从而一方面将不等间隔采样数据变成了等间隔，另一方面也提高了采样的分辨率，再在此基础上继续采用平滑+直接差分法即可。但这样处理会带来两个问题：其一：多次的拟合、平滑、插值会引入较多误差；其二：增加了求导的复杂程度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种荧光定量熔解实验中熔解曲线测量方法，以缓解了现有技术中存在的误差大、复杂度高的技术问题。

第一方面，本发明实施例提供一种荧光定量熔解实验中熔解曲线测量方法，包括：

采集荧光定量熔解实验中非等间隔荧光强度数据；

确定滑动窗口大小以及多项式次数；

对各滑动窗口内荧光强度数据按照多项式次数对应的多项式进行拟合，确定导数矩阵；

基于导数矩阵，计算滑动窗口内各采样点对应的负导数数据，获得平滑后的熔解曲线。

在可选的实施方式中，采集荧光定量熔解实验中非等间隔荧光强度数据的步骤，包括：

采集荧光定量之后扩增子熔解实验中非等间隔的初始荧光强度数据；

针对初始荧光强度数据，去除荧光强度均值，得到非等间隔荧光强度数据。

在可选的实施方式中，确定滑动窗口大小以及多项式次数的步骤，包括：

基于自适用多项式平滑Savitzky-Golay拟合方法，确定荧光强度曲线最优滑动窗口大小和多项式次数。

在可选的实施方式中，基于自适用多项式平滑Savitzky-Golay拟合方法，确定荧光强度曲线最优滑动窗口大小和多项式次数的步骤，包括：

基于Savitzky-Golay拟合方法，获得不同滑动窗口大小和多项式次数下的荧光强度拟合曲线，计算多个决定系数；

根据多个决定系数中最大决定系数，确定荧光强度曲线最优滑动窗口大小和多项式次数。

在可选的实施方式中，对各滑动窗口内荧光强度数据按照多项式次数对应的多项式进行拟合，确定导数矩阵的步骤，包括：