[发明专利]核苷检测方法及其应用

说明书

本发明提供一种核苷的检测方法及应用，本发明所述的方法采用超高效液相色谱法（UPLC）进行CHO宿主细胞培养基及细胞培养上清中有效成分的检测，所述的方法能在15分钟内快速地同时检测出胞苷、次黄嘌呤、尿苷、鸟苷、胸苷及腺苷共6种核苷的成分及含量。

技术领域

本发明属于生物技术领域，本发明涉及一种核苷检测方法及其应用。

背景技术

核苷酸是一类由嘌呤碱或嘧啶碱、核糖或脱氧核糖以及磷酸三种物质组成的化合物，核苷酸是一种小分子物质，在生物体内，核苷酸是一类非常重要的低分子化合物，具有多种重要的生理功能，可以作为脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）的前体，也可以作为生理、生化过程的调节物质参与生物体的物质代谢活动， 如参与生物体的能量代谢，与其相关的三磷酸腺苷（ATP）、脱氢辅酶等。

根据糖的不同，核苷酸可分为核糖核酸及脱氧核糖核酸两类，根据碱基的不同，可分为腺嘌呤核苷酸（腺苷酸、AMP）、鸟嘌呤核苷酸（鸟苷酸、GMP）、胞嘧啶核苷酸（胞苷酸、CMP）、尿嘧啶核苷酸（尿苷酸、UMP）、胸腺嘧啶核苷酸（胸苷酸、TMP）、及次黄嘌呤核苷酸（肌苷酸、IMP）等。

核苷是含氮碱基与糖组分缩合成的糖苷，包含核糖核苷、脱氧核糖核苷两类，常见的核苷有腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶核苷）、及次黄嘌呤核苷等。核苷作为能量来源的一类物质，也会被添加在蛋白质类药物生产过程中宿主细胞的培养基中。

目前生物类药品的制备生产，尤其是蛋白质类药物的制备生产，不再使用早期的由动物脏器或组织中分离的方法取得，而是使用基因工程技术的方法制备生产。使用基因工程技术获得的蛋白质类药物，大大降低了因动物源而引起的用药风险，并且可以明显的降低生产成本，提高蛋白质类药物的生产质量及产量。

在蛋白质类药物的制备生产过程中，常用的方法是将含有需要表达的蛋白质类药物的基因序列的表达载体，转染至合适的宿主细胞中，并进行宿主细胞的培养、表达。其中常用的宿主细胞有原核细胞、真核细胞，现有技术中，蛋白质类药物的大规模生产表达多使用大肠杆菌、酵母菌或哺乳动物细胞，其中CHO细胞（Chinese hamster ovary cell，中国仓鼠卵巢细胞）是最常用的宿主细胞。

中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）哺乳动物表达系统被广泛用于生产蛋白质类药物，其中影响外源基因表达水平的因素有很多，涉及基因的复制、转录和转录后翻译等各级水平；对于整体而言，宿主细胞的生长环境也是一个非常重要的影响因素。

在含有目标蛋白质类药物基因的宿主细胞培养过程中，使用何种宿主细胞培养基是关键的控制因素。在蛋白质类药物的生产过程中，不仅要求宿主细胞本身能够快速生长，也要求该宿主细胞能够更好的表达出目标蛋白质类药物。对于含有不同外援基因的宿主细胞而言，需要不同类型的培养基来满足其生长及外源基因的表达；根据所要求表达的目标蛋白质类药物的性质、结构的不同，选择不同类型的宿主细胞培养基。

所以，中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）哺乳动物表达系统中，宿主细胞使用的培养基种类是影响蛋白质类药物大规模生产表达的重要因素。对于培养基中的各种成分的检测，是确保表达系统能够高效表达的关键技术手段。

发明内容

本发明提供一种核苷的检测方法及应用，本发明所述的方法采用超高效液相色谱法（UPLC）进行CHO宿主细胞培养基及细胞培养上清中有效成分的检测，所述的方法能在15分钟内快速地同时检测出胞苷、次黄嘌呤、尿苷、鸟苷、胸苷及腺苷共6种核苷的成分及含量。

现有的核苷检测方法多为毛细管电泳法和高效液相色谱法（HPLC），只能对少数几个核苷进行同时检测，耗时长、检测核苷种类不够，且目前未有专门针对CHO宿主细胞培养基及细胞培养上清中核苷检测的方法。

现有技术中所提供的核苷检测方法，耗时长、检测成本高，且没有一种方法可以一次性同时检测胞苷、次黄嘌呤、尿苷、鸟苷、胸苷及腺苷共6种核苷的成分及含量。